构建PIS模型并评估手术对缺血脑的影响
建立PIS小鼠模型（胫骨骨折+dMCAO）并检测手术对脑内免疫细胞、梗死体积和神经功能的影响。
术前24小时行胫骨骨折手术，然后行dMCAO。通过scRNA-seq分析脑内细胞组成变化，TTC染色评估梗死体积，伊文思蓝渗漏评估BBB破坏，行为学测试评估神经功能。
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司美格鲁肽靶向Spp1+小胶质细胞/巨噬细胞减轻围术期卒中后的神经炎症
Semaglultide targets Spp1+ microglia/macrophage to attenuate neuroinflammation following perioperative stroke
实验完整度
高研究包含单细胞RNA测序、流式细胞术、免疫荧光、RNA测序、行为学测试等，涵盖体外机制和体内功能验证。
主要模型
PIS小鼠模型（胫骨骨折手术+dMCAO） IS小鼠模型（dMCAO） C57/BL6小鼠
重点核对
PIS模型构建：胫骨骨折手术在dMCAO术前24小时进行 司美格鲁肽给药剂量：30 nmol/kg，腹腔注射，于dMCAO后2小时和1天，随后每2天一次 Spp1+ Mac/MG细胞鉴定：使用scRNA-seq和流式细胞术 神经功能评估：改良Garcia评分、网格行走、胶带去除实验、前肢握力测试
摘要
外周手术可诱发中枢神经系统中的神经免疫激活，并调节缺血脑组织内的免疫细胞极化。然而，术后缺血性脑组织内小胶质细胞和髓系细胞的表型变化仍不明确。利用结合单细胞RNA测序与综合生物学分析的整合方法，在围术期缺血性卒中（PIS）模型中，我们鉴定出一个独特的Spp1阳性巨噬细胞/小胶质细胞（Spp1+ Mac/MG）亚群，该亚群表现出富集的抗炎通路和独特的脂质代谢重编程特征。此外，通过免疫荧光染色，我们在Spp1+F4/80+细胞和Spp1+Iba-1+细胞中检测到胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R）的表达。腹腔注射司美格鲁肽（一种临床上获批用于治疗2型糖尿病的GLP1R激动剂）后，与缺血性卒中（IS）小鼠相比，PIS小鼠的脑梗死体积显著减小。同时，司美格鲁肽治疗还增加了PIS后3天Spp1+EdU+Iba-1+细胞的比例。通过高参数流式细胞术、免疫荧光染色和RNA测序，我们证明司美格鲁肽治疗显著减轻了PIS后小鼠神经炎症标志物的表达。我们还发现，司美格鲁肽治疗显著改善了PIS后长达3天的小鼠感觉运动功能障碍。我们目前的发现揭示了PIS后一种新的保护性Spp1+Mac/MG亚群，并证明司美格鲁肽可上调该亚群。我们提出，使用司美格鲁肽靶向Spp1+Mac/MG亚群可能作为减轻PIS中加剧的神经炎症的一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外周手术如何影响缺血性脑内巨噬细胞/小胶质细胞的转录异质性和功能多样性，以及GLP1R激动剂司美格鲁肽能否调节这些细胞亚群并减轻PIS后的神经炎症。
- 核心机制
- PIS后出现特异性Spp1+Mac/MG亚群，具有抗炎和脂质代谢重编程特征，表达GLP1R。司美格鲁肽通过激活GLP1R，促进Spp1+小胶质细胞增殖，增加Spp1+巨噬细胞/小胶质细胞数量，并抑制神经炎症标志物（如iNOS）表达，从而减轻脑损伤和神经功能缺损。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定出Spp1+ Mac/MG亚群；免疫荧光和流式细胞术验证GLP1R在Spp1+细胞上的表达并增加；RNA测序显示司美格鲁肽处理CD11b+细胞后免疫通路富集改变；行为学测试显示感觉运动功能改善。
- 研究意义
- 研究揭示了一种PIS后新的保护性Spp1+Mac/MG亚群，并表明利用司美格鲁肽靶向该亚群可能是减轻围术期缺血性卒中后加剧的神经炎症的一种有前景的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定PIS脑内Spp1+ Mac/MG亚群
通过单细胞转录组分析明确PIS后出现的特异性巨噬细胞/小胶质细胞亚群。
对脑组织进行scRNA-seq，亚聚类分析外周免疫细胞和微胶质细胞，鉴定出Spp1+ Mac和Spp1+ MG亚群。
验证Spp1+ Mac/MG的抗炎和脂质代谢特征
通过转录组和蛋白水平验证Spp1+Mac/MG的生物学特征。
GSVA、KEGG通路分析，免疫荧光染色检测Arg1、CD36、Spp1在巨噬细胞/小胶质细胞中的共表达。
研究Spp1+MG的起源和增殖
探讨PIS后Spp1+小胶质细胞是否来源于增殖性小胶质细胞分化。
分析Mki67+增殖性小胶质细胞簇，进行拟时间分析和RNA velocity，使用EdU标记增殖细胞，检测Spp1+EdU+小胶质细胞。
检测GLP1R在Spp1+Mac/MG中的表达
验证GLP1R在保护性细胞亚群上的表达，为靶向治疗提供依据。
免疫荧光染色检测GLP1R与Spp1+F4/80+或Spp1+Iba-1+共定位，流式细胞术检测GLP1R+Spp1+细胞百分比。
评估司美格鲁肽对Spp1+Mac/MG和神经炎症的影响
明确司美格鲁肽治疗是否增加Spp1+细胞数量并减轻PIS后的神经炎症。
PIS小鼠腹腔注射司美格鲁肽或PBS，通过免疫荧光、流式细胞术评估Spp1+增殖和细胞数量，RNA-seq分析CD11b+细胞转录组，检测炎症标志物表达。
评估司美格鲁肽对脑损伤和神经功能的影响
检测司美格鲁肽治疗能否减小梗死体积、保护血脑屏障并改善神经行为功能。
MAP2染色评估梗死体积，IgG渗漏评估BBB破坏，检测紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-5、VE-cadherin）表达，进行握力测试评估感觉运动功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物造模 | 双极电凝器 | Shanghai Hutong Electronics Co. Ltd. | -- |
| 不锈钢固定丝 | -- | -- | |
| 药物处理 | 司美格鲁肽 | China peptides Ltd. | -- |
| 梗死体积评估 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC） | Sigma-Aldrich | 298-96-4 |
| BBB评估 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | 314-13-6 |
| 免疫荧光染色 | 抗MAP2抗体 | Abcam | -- |
| 抗CD31抗体 | R&D | -- | |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗Claudin5抗体 | Abcam | -- | |
| 抗VE-钙黏蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Spp1抗体 | Abcam | -- | |
| 抗CD36抗体 | Abcam | -- | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | -- | |
| 抗GLP1R抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Mki67抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Iba-1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 流式细胞术 | 红细胞裂解液 | BD Biosciences | -- |
| 抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠CD11b抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠F4/80抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠Ly6G抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠NK1.1抗体 | R&D | -- | |
| 抗小鼠CD19抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠CD11c抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠Spp1抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠CD8抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠CD4抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 活/死固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34962 | |
| FACS Verse细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA-seq | I型胶原酶 | Sigma | 9001-12-1 |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma | 9001-73-4 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS006344 | |
| Hanks平衡盐溶液 | Solarbio | H1025 | |
| CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 台盼蓝 | Thermo | T10282 | |
| AO-PI染色试剂 | LUNA | D23001 | |
| miRNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | 217084 | |
| Agilent 4200 TapeStation | Agilent Technologies | -- | |
| SMARTer链式总RNA测序试剂盒v2 | Takara | 634413 | |
| scRNA-seq | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | 1000268 | |
| Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000120 | |
| RPMI培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| 磷酸盐缓冲液 | Biological Industries | 02-024-1ACS | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | B2064 | |
| II型胶原酶 | Sigma | C6885 | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma | P4762 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS006344 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| EdU标记 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU） | -- | 61135-33-9 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物建模 | 小鼠品系、性别、年龄：C57/BL6，通常雄性，8-10周龄；手术模式：胫骨骨折在dMCAO前24小时进行；dMCAO手术流程：包括麻醉、颈总动脉结扎、大脑中动脉远端电凝。 阅读提示：Methods: Animals, Murine focal cerebral ischemia model, Bone fracture surgery model |
| 药物处理 | 司美格鲁肽剂量：30 nmol/kg；给药途径：腹腔注射；给药时间：dMCAO后2小时和1天，之后每2天一次；对照组：PBS。 阅读提示：Methods: Drug administration |
| 单细胞测序 | 组织取材：脑梗死周围区域；消化酶组合及浓度：Papain (2 mg/ml)、Collagenase type II (1 mg/mL)、DNase I (200 U/ml)；孵育条件：37°C，45分钟；测序平台：10x Genomics Chromium；文库制备：Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1；测序平台：Illumina NovaSeq6000。 阅读提示：Methods: Singlecell dissociation, Single-cell RNA sequencing |
| 免疫荧光染色 | 切片厚度：25 μm；封闭液：5% donkey serum in 0.3% PBST；一抗孵育：4°C过夜；二抗孵育：室温1小时。 阅读提示：Methods: Immunofluorescence staining |
| 流式细胞术 | 抗体组合：CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, NK1.1, CD19, CD11c, Spp1, CD8, CD4；死活染料：Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain kit (1:1000)；分析软件：FlowJo v10.5.3。 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 神经功能评估 | 测试项目：改良Garcia评分、网格行走测试、粘性去除测试、前肢握力测试；测试时间点：术前和术后指定时间点。 阅读提示：Methods: Evaluation of neurological function |