鉴定紊乱血流诱导的早期染色质可及性变化
确定紊乱血流下内皮细胞染色质可及性变化及AP-1转录因子的参与
对暴露于紊乱血流3小时的HUAECs进行ATAC-seq，比较静态与流动条件下的差异可及性区域，并进行转录因子基序分析。
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PKN1磷酸化内皮细胞组蛋白H3.3丝氨酸31将流动诱导的信号与促动脉粥样硬化基因表达联系起来
Phosphorylation of endothelial histone H3.3 serine 31 by PKN1 links flow-induced signaling to proatherogenic gene expression
实验完整度
高包含体外细胞实验（HUAECs、THP-1）、体内动物模型（内皮特异性PKN1敲除、AAV介导H3.3突变、颈动脉结扎、HFD诱导动脉粥样硬化）、患者样本，并有功能验证和机制验证。
主要模型
人脐动脉内皮细胞（HUAECs） THP-1单核细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） Ldlr−/−小鼠动脉粥样硬化模型
重点核对
HUAECs暴露于紊乱血流（±4 dynes/cm², 1 Hz）的时间点（如3 h） PKN1敲低或H3.3 S31A突变体对FOS/FOSB及炎症基因表达的影响 整合素α5β1拮抗剂ATN-161（10 μM）处理 内皮特异性PKN1敲除小鼠（EC-Pkn1-KO）在部分颈动脉结扎后的血管重塑 Ldlr−/−小鼠高脂饮食16周后动脉粥样硬化斑块面积
摘要
动脉粥样硬化病变优先发生在暴露于紊乱血流的动脉区域，在那里内皮细胞获得炎性表型。紊乱血流如何诱导内皮细胞炎症尚不完全清楚。在这里，我们表明组蛋白H3.3丝氨酸31（H3.3S31）的磷酸化通过允许快速诱导FOS和FOSB来调节紊乱血流诱导的内皮炎症，这是炎症基因表达所必需的。我们确定了蛋白激酶N1（PKN1）是负责紊乱血流诱导的H3.3S31磷酸化的激酶。紊乱血流以整合素α5β1依赖性方式激活PKN1，并诱导其转位到细胞核中，PKN1还参与AP-1转录因子JUN的磷酸化。具有内皮特异性PKN1缺失或内皮表达S31磷酸化缺陷型H3.3突变体的小鼠在体外和体内表现出减少的内皮炎症和紊乱血流诱导的血管重塑。总之，我们确定了一条通路，即紊乱血流通过PKN1介导的组蛋白磷酸化和FOS/FOSB诱导促进炎症基因表达和血管炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 紊乱血流如何诱导内皮细胞炎症？
- 核心机制
- 紊乱血流通过整合素α5β1激活PKN1，PKN1磷酸化H3.3S31，促进FOS/FOSB表达，进而诱导炎症基因表达。
- 主要证据
- HUAECs中PKN1敲低抑制FOS/FOSB诱导，体外激酶实验证明PKN1直接磷酸化H3.3S31，内皮特异性PKN1缺失小鼠减少炎症和动脉粥样硬化。
- 研究意义
- 揭示了组蛋白磷酸化在血流敏感信号传导中的新作用，为动脉粥样硬化治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选PKN1作为FOS/FOSB诱导的关键激酶
鉴定负责紊乱血流诱导FOS/FOSB表达的蛋白激酶
通过siRNA敲低80种激酶，检测对紊乱血流诱导FOS/FOSB表达的影响，发现PKN1敲低最显著抑制。
验证PKN1通过整合素α5β1激活和核转位
确定紊乱血流如何激活PKN1及其亚细胞定位变化
检测不同基质包被条件下PKN1磷酸化，使用ATN-161阻断整合素α5β1，观察PKN1核转位，并在小鼠和人主动脉样本中分析。
证明PKN1直接磷酸化H3.3S31
验证PKN1是否能直接磷酸化H3.3S31
体外激酶实验将重组PKN1与重组H3.3或核小体共孵育，检测H3.3S31磷酸化。
验证H3.3S31磷酸化对FOS/FOSB和炎症基因表达的作用
确定H3.3S31磷酸化是否特异性地调控FOS/FOSB及炎症基因表达
在HUAECs中敲低内源性H3.3并表达野生型或磷酸化位点突变体（S10A、S28A、T11A、S31A），检测紊乱血流诱导的基因表达。
验证PKN1介导的组蛋白修饰参与FOS/FOSB诱导
确定H3.3S31磷酸化通过何种组蛋白修饰机制增强FOS/FOSB表达
检测紊乱血流引起的H3K27ac和H3K36me3变化，并使用ChIP分析这些修饰在FOS/FOSB基因上的富集，敲低EP300或SETD2验证功能。
体内验证PKN1对动脉粥样硬化的作用
验证PKN1在体内介导内皮炎症和动脉粥样硬化发展的功能
利用内皮特异性PKN1敲除小鼠进行部分颈动脉结扎和高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型，分析内皮炎症、血管重塑和斑块面积。
验证PKN1在巨噬细胞中的类似机制
探索PKN1介导的H3.3S31磷酸化是否在其他细胞类型中也起作用
在THP-1细胞和骨髓来源巨噬细胞中敲低PKN1或使用髓系特异性敲除小鼠，检测LPS诱导的H3.3S31磷酸化和炎症基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EGM-2 MV培养基 | Lonza | -- |
| 高糖DMEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| RPMI 1641培养基 | Invitrogen | -- | |
| 剪切应力实验 | μ-Slide I Luer载玻片 | ibidi | 80176 |
| ibidi泵系统 | ibidi | -- | |
| BioTech-Flow系统锥板粘度计 | MOS Technologies | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | 89900 |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL底物 | Pierce | -- | |
| 亚细胞分级 | NE-PER核和细胞质提取试剂盒 | Pierce | -- |
| 体外激酶实验 | 重组人组蛋白H3.3 | Sigma-Aldrich | H2542-100UG |
| 重组人组蛋白H4 | Sigma-Aldrich | H2667-100UG | |
| 重组人组蛋白H3.3多聚核小体 | Active Motif | 31468 | |
| 重组PKN1 | BIOZOL | SCM-P70-11G-10 | |
| [γ-32P]-ATP | Hartmann Analytic | -- | |
| lentiviral transduction | pLVX-IRES-ZsGreen1表达载体 | Clontech | -- |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| AAV感染 | AAV2-QuadYF病毒 | VectorBuilder (Cyagen Biosciences) | -- |
| qRT-PCR | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| ProtoScript II逆转录试剂盒 | New England Biolabs | M0368S | |
| LightCycler 480探针母液系统 | Roche | -- | |
| ChIP assay | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003S |
| AP-1 luciferase reporter assay | AP-1启动子荧光素酶报告构建体 | Addgene | 40342 |
| FuGENE转染试剂 | -- | -- | |
| 双荧光素酶检测系统 | Promega | E1910 | |
| 免疫组织化学 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| Alexa Fluor二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11016, A-11001, A-21443, A-21244 | |
| 封片剂 | Polysciences | 18606-5 | |
| 共聚焦显微镜（Leica SP8 MP） | Leica | SP8 MP | |
| 动物实验 | 6-0丝线缝合线 | Serag-Wiessner | -- |
| 高脂饮食（TD88137） | Ssniff | TD88137 | |
| QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- | |
| miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 组织学与免疫染色 | Fluoromount封片剂 | Sigma-Aldrich | F4680 |
| 油红O | -- | -- | |
| 甘油明胶 | Sigma-Aldrich | 1092420100 | |
| OCT包埋剂 | Tissue-Tek | -- | |
| RNA-seq | miRNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| 无DNase的DNase套装 | Qiagen | -- | |
| LabChip GX Touch 24 | PerkinElmer | -- | |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500测序系统 | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | -- | -- |
| 毛地黄皂苷 | -- | -- | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| NextSeq 2000平台 | Illumina | -- | |
| 抗体 | 抗磷酸化PKN1 (T774)抗体 | Cell Signaling Technology | 2611 |
| 抗FOS抗体 | Cell Signaling Technology | 2250 | |
| 抗FOSB抗体 | Cell Signaling Technology | 2251 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗磷酸化c-JUN (S63)抗体 | Cell Signaling Technology | 91952 | |
| 抗JUN抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| 抗磷酸化JNK (T183/T185)抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2125 | |
| 抗lamin A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 2032 | |
| 抗磷酸化P65 (S536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗P65抗体 | Cell Signaling Technology | 4764 | |
| 抗ICAM1抗体 | Abcam | ab119871 | |
| 抗小鼠VCAM1抗体 | Abcam | ab134047 | |
| 抗小鼠CD31抗体 | Abcam | ab24590 | |
| 抗组蛋白H3S10P抗体 | Abcam | ab5176 | |
| 抗组蛋白H3T11P抗体 | Abcam | ab5168 | |
| 抗组蛋白H3S28P抗体 | Abcam | ab32388 | |
| 抗组蛋白H3.3S31P抗体 | Abcam | ab92628 | |
| 抗组蛋白H3.3抗体 | Abcam | ab176840 | |
| 抗组蛋白H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| 抗组蛋白H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 | |
| 抗组蛋白H3.1/2抗体 | Active Motif | 61629 | |
| 抗人VCAM1抗体 | Bio-Techne | BBA19 | |
| 抗人CD31抗体 | Bio-Techne | AF806 | |
| 抗PKN1抗体 | BD Biosciences | 610687 | |
| 抗磷酸化PKN1抗体 | Kinexus Bioinformatics Corporation | AB-PK781 | |
| 药物处理 | ATN161 | R&D Systems | 6058 |
| 基质包被 | 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141 |
| 多聚左旋赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| IV型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | CC076 | |
| 药物刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 |
| 肿瘤坏死因子 | PeproTech | AF-300-01A-50 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HUAECs培养条件：EGM-2 MV培养基，THP-1细胞使用RPMI 1641，BMDMs分离方法 阅读提示：Methods中的'Cells and cell culture' |
| 剪切应力实验 | 紊乱血流参数：±4 dynes/cm²，1 Hz；使用μ-Slide I Luer载玻片和ibidi泵系统，或BioTech-Flow系统转速28 r.p.m.，振幅40 阅读提示：Methods中的'Shear stress assays' |
| siRNA敲低 | siRNA序列和目标基因：FOS、FOSB、PKN1、EP300、SETD2、H3F3B等；使用Lipofectamine RNAiMAX 阅读提示：Methods中的'siRNA-mediated knockdown'和补充表1 |
| 基因表达分析 | qRT-PCR引物序列，参考基因GAPDH；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒 阅读提示：Methods中的'qRT-PCR analysis'和补充表2 |
| Western blotting | 抗体、稀释度、品牌；细胞裂解液成分；蛋白上样量 阅读提示：Methods中的'Western blotting and subcellular fractionation' |
| 体外激酶实验 | 重组PKN1、底物、ATP浓度、反应时间和温度 阅读提示：Methods中的'In vitro phosphorylation assay' |
| 动物模型 | 小鼠品系、基因型、年龄、性别；部分颈动脉结扎手术细节；高脂饮食持续时间 阅读提示：Methods中的'Animal models'和'Partial carotid artery ligation' |
| 染色质免疫沉淀 | 抗体（H3K27ac、H3K36me3）、固定条件、剪切条件、引物序列 阅读提示：Methods中的'ChIP assay'和补充表2 |