生成并验证VEC特异性Cre小鼠
建立肺静脉内皮细胞特异性、诱导型Cre工具鼠，用于谱系追踪。
通过CRISPR-Cas9将T2A-CreERT2插入Slc6a2基因3'UTR，生成Slc6a2CreERT2小鼠，并与Rosa26RtdTomato杂交，验证其特异性和效率。
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肺静脉内皮细胞的动态行为与谱系可塑性
Dynamic behavior and lineage plasticity of the pulmonary venous endothelium
实验完整度
高研究包含细胞系追踪、动物模型（流感、SARS-CoV-2、高氧损伤）、单细胞RNA测序和功能验证（EdU增殖、分化标记），证据层级多样，验证充分。
主要模型
Slc6a2CreERT2;Rosa26RtdTomato小鼠（静脉内皮细胞谱系追踪） 流感病毒（H1N1 PR8）感染小鼠模型 MA30 SARS-CoV-2感染小鼠模型 高氧暴露小鼠模型
重点核对
Slc6a2CreERT2小鼠的诱导方案：5次他莫昔芬注射（250 mg/kg体重），每次间隔一天，注射后休息一周 流感感染剂量：25-45 TCID50单位，鼻腔内接种 高氧暴露：90%氧气浓度，持续3天，随后恢复正常空气14天 单细胞RNA测序时间点：0、10、20、30天（感染后） 克隆谱系追踪实验使用Cdh5CreERT2小鼠和有限剂量他莫昔芬
摘要
肺血管床的修复和新血管的来源尽管在损伤后满足氧需求方面至关重要，但仍未得到充分探索。鉴于静脉内皮细胞在其他情况下的血管生成中的关键作用，我们研究了静脉内皮细胞在成人肺损伤后内皮再生中的作用。在此，我们确定了Slc6a2作为肺静脉内皮细胞的标志物，并生成了一个静脉特异性、诱导型Cre小鼠品系。我们观察到静脉内皮细胞在流感损伤和高氧损伤后增殖进入邻近的毛细血管床。影像学分析表明，静脉内皮细胞在感染后增殖并分化为普通毛细血管和含气毛细血管内皮细胞，从而有助于修复对气体交换至关重要的毛细血管丛。因此，我们的研究证实，静脉内皮细胞在呼吸道病毒感染和无菌损伤后表现出可证实的祖细胞能力，有助于修复负责肺功能的肺泡毛细血管床。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺静脉内皮细胞是否具有祖细胞能力，并在肺损伤后通过增殖和分化参与毛细血管修复？
- 核心机制
- 静脉内皮细胞在肺损伤后增殖并从静脉出芽，分化为普通毛细血管（gCaps）和含气毛细血管（aCaps）内皮细胞，从而修复毛细血管丛。
- 主要证据
- 通过Slc6a2CreERT2谱系追踪，在流感、SARS-CoV-2和高氧损伤模型中观察到静脉内皮细胞的出芽和分化，且分化后的细胞表达毛细血管标记（如PLVAP、GPIHBP1、CAR4）。
- 研究意义
- 确立静脉内皮细胞作为肺血管祖细胞的储备，为靶向静脉内皮细胞促进肺损伤修复提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肺损伤模型及谱系追踪
观察静脉内皮细胞在肺损伤后的动态行为。
对VEC报告小鼠进行流感（H1N1 PR8）、SARS-CoV-2（MA30）感染或高氧暴露，在指定时间点收集肺组织，通过PCLS成像分析tdTomato+细胞的分布和形态。
静脉出芽的定量分析
定量比较损伤后与对照静脉出芽程度。
使用AngioTool软件对PCLS z-stack最大投影图像进行分支指数分析。
VEC分化为毛细血管内皮细胞的验证
确认静脉内皮细胞是否分化为毛细血管内皮细胞。
对PCLS进行免疫染色，检测BST1（静脉标记）、PLVAP/GPIHBP1（一般毛细血管标记）、CAR4/CD34（含气毛细血管标记）的表达，并测量分支血管直径。
VEC增殖检测
评估静脉内皮细胞在损伤后的增殖能力。
通过EdU掺入实验和流式细胞术检测tdTomato+内皮细胞的增殖比例。
单细胞转录组分析
解析VEC在损伤和修复过程中的转录组动态和细胞命运转变。
在不同时间点（0、10、20、30 DPI）分选TdTomato+ ECs进行scRNA-seq，分析聚类、差异表达、拟时间轨迹和细胞通讯。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
模型构建与谱系追踪
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | PX459 | -- | -- |
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 肺切片制备 | 超纯低熔点琼脂糖 | Invitrogen | -- |
| Leica VT1000 S振动切片机 | Leica | -- | |
| 免疫荧光染色 | ProLong Gold防淬灭封片剂 | Life Sciences | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗小鼠CA4抗体 | R&D Systems | AF2414 | |
| 抗小鼠BST1抗体 | BioLegend | 140207 | |
| 抗小鼠ERG抗体 | Abcam | ab92513 | |
| 抗小鼠PLVAP抗体 | Hybridoma Bank | MECA-32 | |
| 抗小鼠RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 抗小鼠RFP抗体 | Rockland | 200-101-379 | |
| 抗小鼠VEGFR3抗体 | R&D Systems | AF743 | |
| 抗小鼠SYP抗体 | Proteintech | 17785-1-AP | |
| 抗小鼠RAGE抗体 | R&D Systems | MAB1179-100 | |
| 抗小鼠DC-LAMP抗体 | Novus Biologicals | DDX0192P-100 | |
| 抗小鼠KRT5抗体 | BioLegend | 905901 | |
| 抗小鼠EBF1抗体 | R&D Systems | AF5165 | |
| 抗小鼠PDGFRα抗体 | R&D Systems | AF1062 | |
| 抗小鼠GPIHBP1抗体 | Novus Biologicals | NB110-41537 | |
| 抗小鼠CD34抗体 | BioLegend | 119309 | |
| GSL I凝集素B4，荧光素标记 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| 脉管灌注 | 番茄凝集素 | Vector Laboratories | B-1175-1 |
| Dylight 488标记番茄凝集素 | Vector Laboratories | DL-1174-1 | |
| Alexa Fluor 488标记链霉亲和素 | BioLegend | 405235 | |
| 支气管肺泡灌洗 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 细胞消化 | II型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004176 |
| 脱氧核糖核酸酶I | MilliporeSigma | D4527 | |
| 流式细胞术 | Draq7染料 | BioLegend | 424001 |
| eBioscience固定化活力染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 | |
| Brilliant Violet 785标记抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103149 | |
| PE-Cyanine7标记抗小鼠PECAM/CD31 | BioLegend | 102523 | |
| APC标记抗小鼠BST1/CD157 | BioLegend | 140207 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSAria Fusion分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| EdU检测 | Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒 | Life Technologies | C10086 |
| 单细胞转录组 | 10x Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 高氧暴露 | ProOx360单气体控制器 | BioSpherix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 谱系追踪诱导 | 他莫昔芬注射剂量（250 mg/kg）、次数（5次）、间隔（隔天一次）、注射途径（腹腔注射） 阅读提示：详见Methods 'Influenza lung injury'和'Adult hyperoxia lung injury'部分 |
| 流感损伤模型 | 病毒株（A/H1N1/PR/8）、剂量（25-45 TCID50单位）、接种体积（30 μl）、体重下降标准（≥15%）、年龄（8-12周） 阅读提示：详见Methods 'Influenza lung injury'部分 |
| SARS-CoV-2损伤模型 | 病毒株（MA30）、剂量（10^4 PFU）、接种体积（40 μl）、年龄（≥3个月）、麻醉方案（氯胺酮-赛拉嗪） 阅读提示：详见Methods 'Mouse-adapted SARS-CoV-2 injury'部分 |
| 高氧损伤模型 | 氧气浓度（90%）、暴露时间（3天）、恢复时间（14天）、他莫昔芬处理与高氧暴露的时序 阅读提示：详见Methods 'Adult hyperoxia lung injury'部分 |
| PCLS制备 | 琼脂糖浓度（2%）、固定时间（3.2% PFA 1小时）、切片厚度（300 μm） 阅读提示：详见Methods 'PCLSs'部分 |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释比例、孵育时间（PCLS 3天，切片过夜）、洗涤次数 阅读提示：详见Methods 'Immunofluorescence'部分和相应图例 |
| EdU增殖检测 | EdU剂量（50 mg/kg）、注射频率（每两天）、给药时间（感染后第3天至收获）、检测试剂盒 阅读提示：详见Methods 'EdU treatment and analysis'部分 |
| 单细胞RNA测序 | 细胞分选策略（TdTomato+/CD31+/CD45−）、时间点（0、10、20、30 DPI）、平台（10x Genomics）、测序深度 阅读提示：详见Methods 'Single-cell transcriptomics'部分和图例 |