构建衰老乳腺组织单细胞图谱
获取年轻和年老小鼠乳腺组织中不同细胞类型的高分辨率转录组和染色质可及性图谱。
分离3月龄和18月龄C57BL/6J雌性小鼠乳腺组织，通过scRNA-seq和snATAC-seq分析细胞组成和基因表达。
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健康乳腺组织的综合单细胞衰老图谱揭示了衰老与癌症共有的表观基因组和转录组特征
Comprehensive single-cell aging atlas of healthy mammary tissues reveals shared epigenomic and transcriptomic signatures of aging and cancer
实验完整度
高包含scRNA-seq、snATAC-seq、空间转录组和TCGA数据等多个独立证据层级，并通过功能基因表达和染色质可及性分析进行验证。
主要模型
3月龄和18月龄C57BL/6J雌性处女鼠乳腺组织 人类TCGA乳腺癌肿瘤及正常组织样本
重点核对
小鼠年龄分组（3月龄 vs 18月龄）及共饲养条件 scRNA-seq样本数（n=6/年龄）及snATAC-seq样本数（n=3/年龄） 组织解离采用两步骤裂解方案以保留敏感免疫细胞并捕获上皮和基质细胞 细胞分选通过流式细胞术基于Calcein+PI-活细胞
摘要
衰老是乳腺癌最大的风险因素；然而，与年龄相关的细胞和分子事件如何影响癌症发生尚不清楚。在本研究中，我们探讨了衰老如何在单细胞分辨率下重塑小鼠乳腺的转录组和表观基因组程序，为衰老和癌症生物学提供了全面的资源。衰老的上皮细胞在代谢、促炎和癌症相关基因中表现出表观遗传和转录变化。衰老的基质细胞下调成纤维细胞标志基因，并上调衰老和癌症相关成纤维细胞的标志物。在免疫细胞中，不同的T细胞亚群（Gzmk+、记忆CD4+、γδ）和M2样巨噬细胞随年龄增长而扩增。空间转录组学揭示了衰老免疫细胞和上皮细胞在原位的共定位。最后，我们在人类乳腺肿瘤中发现了衰老乳腺细胞的转录特征，提示衰老与癌症之间可能存在联系。总之，这些数据揭示了上皮细胞、免疫细胞和基质细胞在比例和细胞身份上的变化，可能影响细胞可塑性、衰老微环境和肿瘤形成风险。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老如何重塑小鼠乳腺组织的转录组和表观基因组程序，并与癌症发生相关联？
- 核心机制
- 衰老导致上皮、免疫和基质细胞的细胞身份标志物表达改变，提示谱系保真度降低和细胞可塑性增加；染色质可及性变化可能驱动相关基因表达改变。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和snATAC-seq分析，发现衰老上皮细胞中代谢、促炎和癌症相关基因的表观和转录变化；衰老基质细胞下调成纤维细胞标志基因、上调衰老和CAF标志物；免疫细胞中Gzmk+ T、记忆CD4+和γδ T细胞及M2样巨噬细胞扩增；空间转录组学显示衰老免疫细胞与上皮细胞在原位共定位。
- 研究意义
- 为理解衰老与乳腺癌之间的关联提供了单细胞资源，并提示衰老细胞的转录特征可能存在于人类乳腺肿瘤中，为癌症预防和治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析衰老相关的细胞组成变化
确定哪些细胞类型在衰老过程中比例发生变化。
基于scRNA-seq和snATAC-seq数据进行细胞聚类，比较不同年龄组中各细胞类型的比例。
鉴定衰老相关的基因表达和染色质可及性变化
分析衰老如何影响不同细胞类型的转录组和表观基因组状态。
对上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞进行差异基因表达和差异染色质可及性分析，并进行转录因子活性推断。
细胞亚群分析
揭示特定细胞亚群在衰老过程中的变化和功能特征。
对上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞进行无监督亚聚类，分析亚群比例、标志基因表达和功能特征。
空间转录组学验证细胞共定位
在组织原位验证衰老相关免疫细胞与上皮细胞的相互作用。
对18月龄和3月龄小鼠乳腺组织进行空间转录组分析，检测免疫细胞标志基因以及与配体-受体对共表达的位点。
与人类乳腺癌数据的比较分析
评估小鼠衰老相关基因表达变化是否在人类乳腺癌中保守。
将小鼠衰老差异表达基因与TCGA人类乳腺肿瘤和正常组织样本的差异表达基因进行比较，计算重叠和统计显著性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组分析
空间转录组分析
差异表达分析
转录因子活性分析
配体-受体相互作用分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞解离 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 11320-033 |
| 胎牛血清 | Seradigm | 1500-500 | |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-054 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750 | |
| DNA酶I | Invitrogen | 18068 | |
| TrypLE | Gibco | 12604 | |
| ACK裂解液 | Gibco | A10492 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Invitrogen | C1430 |
| 钙黄绿素 | BD | 556463 | |
| scRNA-seq | 10x Chromium v.3试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| snATAC-seq | 10x Chromium v.1试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| scRNA-seq | Agilent 4200 TapeStation | Agilent | -- |
| KAPA qPCR | KAPA | -- | |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| snATAC-seq | Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | -- |
| 空间转录组 | Rneasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| NanoZoomer SQ | Hamamatsu | -- | |
| CytAssist | 10x Genomics | -- | |
| TapeStation高灵敏度DNA ScreenTape | Agilent | -- | |
| Qubit | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物饲养 | LabDiet 5K0G饲料 | LabDiet | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6J；性别：雌性；年龄：3月龄（年轻）和18月龄（年老）；处女；共饲养至少1个月 阅读提示：Methods: Experimental model |
| 细胞解离 | 消化液组成：DMEM/F-12, 4% FBS, 1.5 mg/ml collagenase IV, 0.2% trypsin, 5 µg/ml insulin, 2.5 µg/ml gentamycin；消化时间：15分钟和20分钟；DNAse I处理；TrypLE处理；ACK裂解 阅读提示：Methods: Tissue dissociation for single-cell analysis |
| scRNA-seq | 细胞活力计数；载入细胞数：12,000；目标回收细胞：6,000；数据过滤标准：基因数<500，线粒体比例>10% 阅读提示：Methods: scRNA-seq and snATAC-seq library preparation; scRNA-seq data processing |
| snATAC-seq | 细胞核数载入：9,250；数据过滤标准：总片段数在1000-100000之间，peak比例>40%，黑名单比例<0.01，核小体信号<4，TSS富集分数>2 阅读提示：Methods: scRNA-seq and snATAC-seq library preparation; snATAC-seq data processing |
| 空间转录组 | 组织固定：FFPE；切片厚度：15 µm；DV200>50%；CytAssist转移；测序深度：100,000 read pairs/spot 阅读提示：Methods: ST profiling of aged mammary tissues |