单细胞多组学图谱构建
表征CK-AML的结构变异、核小体占位、转录组和表面蛋白组。
对8例诊断或挽救性样本、5例PDX样本和2例复发/难治样本进行单细胞Strand-seq和CITE-seq测序，使用scTRIP检测结构变异，使用scNOVA分析核小体占位。
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单细胞多组学分析揭示复杂核型急性髓系白血病的动态克隆演化与可靶向表型
Single-cell multiomics analysis reveals dynamic clonal evolution and targetable phenotypes in acute myeloid leukemia with complex karyotype
实验完整度
高包含单细胞多组学（Strand-seq、CITE-seq）、PDX模型、体外药物筛选、纵向患者样本分析等多个独立证据层级，并包含功能验证（异种移植）和机制验证（结构变异、转录组分析）。
主要模型
8例原发CK-AML患者骨髓或外周血样本 患者来源异种移植瘤（PDX）模型 纵向患者样本（诊断-复发/难治） 体外药物筛选中的原代AML细胞
重点核对
单细胞结构变异分析使用scTRIP方法，细胞数范围44-91个/样本 PDX模型使用NSG小鼠，移植细胞数1×10^6-2×10^6，亚致死照射175cGy 体外药物筛选使用0.5×10^5 AML细胞/孔，处理24小时或72小时 CITE-seq数据使用CONICSmat进行SCNA召回，后验概率阈值0.8 亚克隆定义：≥3个细胞共享结构变异
摘要
染色体不稳定是肿瘤内异质性（ITH）的主要驱动因素，促进肿瘤进展。在本研究中，我们将结构变异检测和核小体占位分析与单细胞转录组和免疫表型变化相结合，以研究复杂核型急性髓系白血病（CK-AML）的ITH。我们观察到CK-AML患者个体细胞中复杂的结构变异景观，其特征为线性和环状断裂-融合-桥循环以及染色体碎裂。我们在诊断或挽救性CK-AML中识别出三种克隆演化模式（单克隆、线性和分支多克隆），其中75%的患者存在多个亚克隆，且频繁表现出持续的核型重塑。利用患者来源的异种移植瘤，我们证明了白血病干细胞（LSCs）的不同克隆演化，并进一步剖析了亚克隆特异性药物反应谱，以识别靶向LSC的疗法，包括BCL-xL抑制。在配对的纵向患者样本中，我们进一步揭示了遗传演化和细胞类型可塑性是疾病进展的机制。通过剖析CK-AML的动态基因组、表型和功能复杂性，我们的发现为表征和靶向致病性LSCs提供了临床相关途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 复杂核型急性髓系白血病（CK-AML）中肿瘤内异质性的基因组、表观基因组和表型特征如何，以及这些特征如何驱动疾病进展和治疗耐药？
- 核心机制
- 染色体不稳定产生复杂结构变异（包括碎裂、断裂-融合-桥循环、地震式扩增）驱动克隆演化；不同亚克隆呈现不同转录组和免疫表型，且亚克隆特异性功能差异（如氧化磷酸化、细胞周期、应激反应）影响药物敏感性和复发。
- 主要证据
- 单细胞多组学（scNOVA和CITE-seq）分析显示不同克隆演化模式；PDX模型显示不同亚克隆的植入能力；体外药物筛选显示亚克隆特异性药物反应；纵向样本显示复发/难治时亚克隆获得新结构变异和表型转变。
- 研究意义
- 研究为CK-AML的克隆演化提供了单细胞水平见解，并揭示了潜在治疗靶点（如BCL-xL抑制），支持基于亚克隆的精准治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
克隆演化模式分析
确定CK-AML亚克隆生长模式。
基于结构变异亚克隆分析，根据亚克隆共享结构变异，将样本分类为单克隆、线性或分支多克隆生长。
转录组与表观基因组整合
将结构变异亚克隆与转录组和表观基因组特征联系起来。
利用CONICSmat从CITE-seq数据召回SCNA，将细胞分配到亚克隆，并分析亚克隆特异性基因表达和通路活性。
患者来源异种移植实验
评估不同亚克隆的体内重建能力。
将CD3+T细胞去除的CK-AML细胞注射入亚致死照射的NSG小鼠股骨骨髓腔，监测人源细胞植入，通过流式分析评估，并在终点通过scNOVA分析结构变异。
体外药物敏感性筛选
测试不同亚克隆对多种药物的敏感性。
使用流式细胞术基于CITE-seq鉴定的表面标记分选亚克隆，并对原代细胞进行24或72小时药物处理，评估活力。
纵向样本分析
追踪治疗压力下的克隆演化。
对配对诊断-复发或难治样本进行scNOVA-CITE分析，比较结构变异、细胞类型组成和基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结构变异检测
异种移植
药物敏感性检测
细胞类型注释
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| BIT（牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白） | STEMCELL Technologies | 09500 | |
| 粒细胞集落刺激因子 | PeproTech | 300-23 | |
| FMS样酪氨酸激酶3配体 | PeproTech | 300-19 | |
| 干细胞因子 | PeproTech | 300-07 | |
| 白细胞介素-3 | PeproTech | 200-03 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| SR1（StemRegenin 1） | STEMCELL Technologies | 72342 | |
| UM729 | STEMCELL Technologies | 72332 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Strand-seq | 溴脱氧尿苷 | -- | -- |
| 细胞分选 | BD FACSMelody细胞分选仪 | BD | -- |
| CITE-seq | Chromium单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒 | 10x Genomics | 1000128 |
| 抗体标签 | 抗体衍生标签 | -- | -- |
| Hashtag抗体 | Hashtag寡核苷酸 | -- | -- |
| 细胞分选 | BD FACSAria II或III | BD | -- |
| 测序 | Illumina NextSeq 500 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 异种移植 | 人CD3微珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-101 |
| 流式分析 | 抗人CD45-AF700抗体 | BD Biosciences | 560566 |
| 抗人CD34-BUV395抗体 | BD Biosciences | 563778 | |
| 抗人CD38-BUV496抗体 | BD Biosciences | 612946 | |
| 抗人GPR56-PE抗体 | BioLegend | 358204 | |
| 抗人CD19-APC抗体 | eBioscience | 17-0199-42 | |
| 抗人CD33-APC抗体 | BioLegend | 740974 | |
| 抗小鼠CD45-FITC抗体 | eBioscience | 11-0451-82 | |
| 细胞冻存 | Cryostore冷冻保护剂 | Sigma-Aldrich | C2874-100 |
| 光学基因组图谱 | Saphyr仪器 | Bionano Genomics | -- |
| Bionano Solve软件 | Bionano Genomics | -- | |
| M-FISH | 中期染色体铺展 | -- | -- |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 链霉亲和素Alexa Fluor-750偶联物 | Invitrogen | S21384 | |
| 生物素化山羊抗亲和素 | Vector | BA-0300 | |
| 山羊抗兔IgG Cy5.5 | Linaris | PAK0027 | |
| DMRXA荧光显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 体外药物筛选 | CountBright计数磁珠 | Thermo Fisher Scientific | C36950 |
| BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD | -- | |
| 细胞内染色 | Zombie NIR固定活性染料 | BioLegend | 423105 |
| 固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| 透化缓冲液Plus | BD Biosciences | 561651 | |
| 抗人BCL-2-AF647抗体 | Cell Signaling | 82655 | |
| 抗人MCL-1-AF488抗体 | Cell Signaling | 58326 | |
| 抗人BCL-xL-PE-Cy7抗体 | Cell Signaling | 81965 | |
| 药物处理 | 维奈克拉 | -- | -- |
| 阿扎胞苷 | -- | -- | |
| 阿糖胞苷 | -- | -- | |
| 柔红霉素 | -- | -- | |
| A-1331852 | -- | -- | |
| 艾司洛莫 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本处理与单细胞测序 | 患者样本类型、细胞培养条件、Strand-seq和CITE-seq的具体参数（如细胞数、抗体数、测序平台） 阅读提示：Methods: Processing of primary AML cells for single-cell sequencing, Strand-seq in leukemia cells, CITE-seq in leukemia cells |
| 结构变异分析 | 分析软件版本、参数设置（如MAPQ阈值、bin大小、后验概率阈值）、亚克隆定义标准 阅读提示：Methods: Strand-seq-based structural variant discovery, Supplementary Methods |
| 异种移植 | 小鼠品系、周龄、性别、照射剂量、移植细胞数、植入监测时间点 阅读提示：Methods: Mouse experiments, Xenotransplantations |
| 体外药物筛选 | 药物浓度、处理时间、细胞密度、检测方法（流式） 阅读提示：Methods: Ex vivo drug screening |
| CITE-seq数据处理 | Seurat版本、归一化方法、维度选择、SCNA召回参数 阅读提示：Methods: CITE-seq data pre-processing and integration, Quality control of CITE-seq data |