评估人类和小鼠MASH中的草酸盐代谢失调
确定MASH中草酸盐代谢相关基因表达、酶活性及草酸盐水平的变化。
分析了多个独立人类队列（GSE26106, GSE83452, GSE61260）及临床肝脏/血浆样本，检测了AGXT、LDHA等基因表达、蛋白水平、酶活性及草酸盐浓度；同时检测了MASH饮食（12周和24周）和FPC饮食（16周）喂养的小鼠肝脏中的相应指标。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抑制肝脏草酸盐过度生成可改善代谢功能障碍相关脂肪性肝炎
Inhibition of hepatic oxalate overproduction ameliorates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis
实验完整度
高包含多个人类队列、多种MASH小鼠模型及体外肝细胞实验，并进行了遗传（AGXT过表达）和药理（LDHA/GO抑制）干预，结合转录组、脂质组及功能验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠MASH模型（高脂高果糖高胆固醇饮食） C57BL/6J小鼠FPC饮食MASH模型 原代小鼠肝细胞 HepG2人肝癌细胞系 MASH患者肝脏及血浆样本
重点核对
MASH患者及小鼠肝脏中AGXT表达下调、LDHA活性升高及草酸盐水平 肝细胞特异性AGXT过表达（AAV8-TBG-AGXT，2×10^11病毒基因组/只）对MASH小鼠肝脏草酸盐、脂肪变性、炎症和纤维化的影响 MDMG-935P（10 mg/kg/day，口服）对已建立MASH小鼠肝脏草酸盐、脂肪变性、炎症和纤维化的影响 草酸盐（NaOX，原代肝细胞250 μM，HepG2细胞500 μM）对肝细胞PPARα表达、脂肪酸β-氧化和脂质积累的影响 RNA测序和脂质组学分析中AGXT过表达或MDMG-935P处理组与对照组的差异
摘要
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的发病率正在上升，且可用药物治疗有限，因此迫切需要确定新的代谢靶点。草酸盐是肝脏乳酸脱氢酶（LDHA）由乙醛酸产生的终末代谢产物。肝脏特异性的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（AGXT）可解毒乙醛酸，防止草酸盐积累。在此我们表明，在MASH患者和小鼠的肝脏中，AGXT受到抑制而LDHA被激活，导致草酸盐过度产生。反过来，草酸盐通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARα）转录和脂肪酸β-氧化促进肝细胞脂肪变性，并通过C-C基序趋化因子配体2诱导单核细胞趋化。在饮食诱导的MASH雄性小鼠中，通过肝细胞特异性AGXT过表达或药理学抑制LDHA来靶向草酸盐过度产生，可通过诱导PPARα驱动的脂肪酸β-氧化和抑制单核细胞趋化、核因子-κB和转化生长因子-β靶标，有效降低脂肪性肝炎和纤维化。这些发现凸显了肝脏草酸盐过度产生作为治疗MASH的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝脏草酸盐代谢在MASH中的调控机制及其作为治疗靶点的潜力尚不清楚。
- 核心机制
- MASH中AGXT受抑、LDHA激活导致肝脏草酸盐过度产生；草酸盐通过抑制PPARα转录和脂肪酸β-氧化促进肝细胞脂肪变性，并通过上调CCL2诱导单核细胞趋化，从而加剧脂肪性肝炎和纤维化。
- 主要证据
- 基于人类MASH队列、小鼠MASH模型、原代肝细胞和HepG2细胞实验，结合AGXT过表达和LDHA/GO抑制（MDMG-935P）的遗传和药理学干预，通过转录组、脂质组、组织学及功能分析验证。
- 研究意义
- 靶向肝脏草酸盐过度产生（如通过AGXT过表达或抑制LDHA/GO）可能成为治疗MASH的新策略，并可能对MASH相关心血管疾病具有双重治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证肝细胞特异性AGXT过表达对MASH的影响
确定降低肝脏草酸盐水平是否能改善MASH。
通过AAV8-TBG-AGXT载体在肝细胞中特异性过表达AGXT，然后喂食MASH饮食24周，评估其对肝脏草酸盐、肝损伤指标、组织学、脂肪变性、炎症和纤维化的影响。
阐明AGXT过表达改善肝脏脂肪变性的机制
探索降低草酸盐水平对肝脏脂质代谢的影响及其分子机制。
对AGXT过表达和对照小鼠的肝脏进行RNA测序和脂质组学分析，验证脂肪酸氧化（FAO）相关基因表达、脂质积累、甘油三酯和氧化应激标志物。
验证草酸盐对肝细胞脂质代谢的直接作用
确定草酸盐是否直接促进肝细胞脂质积累及其机制。
用外源性草酸盐（NaOX）或草酸盐前体（羟脯氨酸、乙醇酸）处理原代肝细胞和HepG2细胞，检测脂质积累、PPARα及其靶基因表达、线粒体呼吸和PPARα转录活性。
验证AGXT过表达对肝脏炎症和纤维化的影响
确定降低肝脏草酸盐是否能抑制MASH相关的炎症和纤维化。
通过RNA测序、qRT-PCR、组织学和免疫荧光分析评估AGXT过表达对炎症通路、巨噬细胞亚群、肝星状细胞活化和胶原沉积的影响。
评估药理学抑制草酸盐产生的治疗效果
确定在已建立的MASH中，通过药物抑制草酸盐产生是否能改善疾病。
在喂食MASH饮食12周后的小鼠中，口服给予MDMG-935P（GO和LDHA双抑制剂）12周，评估其对肝脏草酸盐、肝损伤、脂肪变性、炎症和纤维化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织学 | 天狼星红染色剂 | Rowley Biochemical | -- |
| 免疫荧光 | F4/80抗体 | Bio-Rad ABD Serotec | MCA497R |
| CCR2抗体 | Abcam | ab273050 | |
| TREM2抗体 | Proteintech | 27599-1-AP | |
| Ly6G抗体 | Thermo Scientific | 11-9668-82 | |
| α-SMA抗体 | Sigma | C6198 | |
| Arg1抗体 | Sigma | HPA024006 | |
| Western blot | AGXT抗体 | Sigma | HPA035370 |
| LDHA抗体 | Cell Signalling Technology | 2012 | |
| CPT1α抗体 | Abcam | ab234111 | |
| PPARA抗体 | Proteintech | 15540-1-AP | |
| HAO1抗体 | Abcam | 194790 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signalling Technology | 3700S | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc365062 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74106 | |
| 逆转录 | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080-051 |
| qRT-PCR | SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 175271 |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | G Biosciences | 786-489 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78429 | |
| 生化分析 | EnzyChrom天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | BioAssay Systems | EASTR-100 |
| EnzyChrom丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | BioAssay Systems | EALT-100 | |
| 草酸盐检测 | 草酸盐检测试剂盒 | Abcam | ab196990 |
| LDH活性检测 | LDH检测试剂盒 | Abcam | ab102526 |
| 甘油三酯检测 | LabAssay甘油三酯检测试剂盒 | Fuji Film | 632-50991 |
| 羟脯氨酸检测 | 羟脯氨酸检测试剂盒 | Abcam | ab222941 |
| MDA检测 | TBARS检测试剂盒 | Cayman Chemical Company | 10009055 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 1059-010 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10438-026 | |
| 青霉素/链霉素 | GenClone | 25-512 | |
| 细胞处理 | 草酸钠（NaOX） | Sigma | 223433 |
| BSA偶联棕榈酸（PA） | Cayman Chemical Company | 29558 | |
| BSA对照 | Cayman Chemical Company | 29556 | |
| Wy 14,643 | Cayman Chemical Company | 70730 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 |
| CCL2 siRNA | Dharmacon | L-007831-00-000 | |
| 乱序siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | |
| Seahorse分析 | XF24细胞培养微孔板 | Agilent | 103015-100 |
| 依托莫司 | Cayman Chemical Company | 11969 | |
| Transwell实验 | Millicell细胞培养悬挂式小室 | Millipore | PTEP24H48 |
| Vybrant DiO细胞标记液 | Invitrogen | V22886 | |
| 单核细胞分离 | Ficoll Histopaque 1077分离液 | Sigma | -- |
| AAV生产 | PEI转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| Benzonase核酸酶 | -- | -- | |
| 泊洛沙姆188 | Sigma-Aldrich | -- | |
| AAV纯化 | 100-kDa超滤管 | Millipore | 910096 |
| IC-MS | Thermo Scientific Dionex ICS-6000+系统 | Thermo Scientific | -- |
| Thermo IonPac AS11色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Thermo Orbitrap IQ-X Tribrid质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 脂质组学 | Accucore C30色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 酶学检测 | Quick-gDNA MiniPrep试剂盒 | Zymo Research | D3024 |
| RRBS | Ovation RRBS甲基化测序系统 | Tecan | 0353-32 |
| EpiTect Fast DNA亚硫酸氢盐试剂盒 | QIAGEN | 59824 | |
| TaqaI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0149 | |
| MspI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0106 | |
| qPCR定量 | KAPA文库定量试剂盒 | Roche | KK4835 |
| RNA-seq文库构建 | Stranded mRNA Prep, Ligation试剂盒 | Illumina | -- |
| 肝细胞分离 | 肝脏灌流培养基 | Gibco | 17701038 |
| 肝脏消化培养基 | Gibco | 17703034 | |
| William's E培养基 | Gibco | A1217601 | |
| 解冻和铺板补充剂 | Gibco | CM3000 | |
| 维持补充剂 | Gibco | CM4000 | |
| Percoll分离液 | Cytiva | 45-001-748 | |
| 染色 | 尼罗红 | TCI Chemicals | N0659 |
| DAPI | MP Biometicals | 0215757410 | |
| MitoSOX荧光染料 | Invitrogen | M36008 | |
| Hoechst核染色 | Thermo Scientific | 62249 | |
| 显微成像 | Keyence BZ-X810一体化荧光显微镜 | Keyence | -- |
| Nikon Eclipse TS2R-FL显微镜 | Nikon | -- | |
| 动物实验 | MASH饮食 | Research Diets | D17010103 |
| MASH饮食 | Envigo | TD.160785 | |
| 标准饮食 | LabDiet | 5053 | |
| MDMG-935P | -- | -- | |
| AAV8-AGXT | -- | -- | |
| AAV8-GFP | -- | -- | |
| 0.5%甲基纤维素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人类队列分析 | MASH诊断标准、肝脏/血浆样本收集方法、NAS评分、AGXT和LDHA表达及活性检测、草酸盐浓度检测方法 阅读提示：Methods: Human studies; Results 部分 Fig. 1 相关描述; Extended Data Fig. 1 |
| 小鼠MASH模型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（8周龄）、饮食配方（Research Diets D17010103或Envigo TD.160785）、喂养时长（12或24周） 阅读提示：Methods: Animal studies; Results 部分 Fig. 1h-i 和 Extended Data Fig. 2a-b |
| AGXT过表达实验 | AAV8-TBG-AGXT或AAV8-TBG-GFP病毒剂量（2×10^11病毒基因组/只）、注射途径（腹腔）、MASH饮食喂养时间（24周） 阅读提示：Methods: Animal studies; Results 部分 Fig. 2a |
| MDMG-935P治疗实验 | MDMG-935P剂量（5或10 mg/kg/day）、给药途径（口服灌胃）、溶剂（0.5%甲基纤维素）、治疗时机（MASH饮食12周后给药12周） 阅读提示：Methods: Animal studies; Results 部分 Fig. 7b |
| 原代肝细胞和HepG2细胞实验 | NaOX浓度（原代肝细胞250 μM，HepG2细胞500 μM）、PA浓度（200 μM）、处理时间（过夜）、羟脯氨酸和乙醇酸浓度（10 mM） 阅读提示：Methods: Cell culture, treatments and polarized microscopy; Results 部分 Fig. 4 |