细胞模型培养与分化
获取适合检测染色质构象和基因表达的代谢相关细胞模型。
培养EndoC-BH1、HepG2、SGBS_undiff细胞，并诱导SGBS_undiff分化为SGBS_diff。
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利用启动子聚焦的Capture-C在相关代谢细胞模型中鉴定2型糖尿病效应基因
Implicating type 2 diabetes effector genes in relevant metabolic cellular models using promoter-focused Capture-C
实验完整度
高包含多组学数据生成（Capture-C、ATAC-seq、RNA-seq）、生物信息学分析（LDSC、V2G）、以及功能验证（siRNA敲低、GSIS实验），多层级验证。
主要模型
EndoC-BH1细胞（胰腺β细胞） HepG2细胞（肝细胞） SGBS细胞（前脂肪细胞及分化脂肪细胞）
重点核对
细胞系：EndoC-BH1、HepG2、SGBS_undiff、SGBS_diff siRNA处理：非靶向对照（50 nmol/l）、FXR2 siRNA（50 nmol/l）、SMCO4 siRNA（37.5 nmol/l） 葡萄糖刺激浓度：0 mmol/l、20 mmol/l IBMX浓度：45 µmol/l ELISA试剂盒：Mercodia Human Insulin ELISA kit (Cat# 10-1113-01)
摘要
目的/假设：全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数百个2型糖尿病位点，其中绝大多数信号位于非编码区；因此，这些变异影响哪些‘效应’基因在很大程度上仍不清楚。确定这些效应基因一直受到其假设发挥作用的相对具有挑战性的细胞环境的阻碍。方法：为了鉴定此类效应基因，我们选择生成并整合高分辨率启动子聚焦的Capture-C、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和RNA-seq数据集，以表征与2型糖尿病相关的多种细胞系中的染色质和表达谱，用于后续功能验证分析：EndoC-BH1（胰腺β细胞）、HepG2（肝细胞）和Simpson–Golabi–Behmel综合征（SGBS；脂肪细胞）。结果：随后的变异-基因分析在370个2型糖尿病风险位点中鉴定出810个候选效应基因。使用分区连锁不平衡得分回归，我们观察到EndoC-BH1细胞中启动子连接的假定顺式调控元件中2型糖尿病和空腹血糖GWAS位点的富集，以及SGBS细胞中空腹胰岛素GWAS位点的富集。此外，作为原理验证，当我们在EndoC-BH1细胞中敲低SMCO4基因表达时，我们观察到胰岛素分泌的统计学显著增加。结论/解释：这些结果为在易处理的细胞模型中比较组织特异性数据（相对于相对具有挑战性的原代细胞环境）提供了资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用相关代谢细胞模型中的染色质构象和开放染色质数据，将2型糖尿病风险变异映射到效应基因？
- 核心机制
- 非编码风险变异可能通过改变顺式调控元件活性，进而通过染色质环调控远端基因表达，SMCO4可能通过未知机制抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
- 主要证据
- 通过整合promoter-focused Capture-C、ATAC-seq和RNA-seq数据，鉴定出810个候选效应基因；在EndoC-BH1中敲低SMCO4后，GSIS显著增加（约18%，p=0.0243）。
- 研究意义
- 该研究提供了一种在易处理的细胞模型中优先排序和验证2型糖尿病效应基因的资源，有助于后续功能研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学数据生成
表征各细胞模型的染色质构象、开放染色质和基因表达谱。
为每种细胞生成promoter-focused Capture-C、ATAC-seq和RNA-seq文库并测序。
生物信息学分析与V2G映射
将2型糖尿病GWAS信号映射到候选效应基因，并评估细胞模型的特异性。
对OCR进行注释，进行分区LD score回归，整合GWAS数据，预测转录因子结合位点破坏，与已有数据库比较。
功能验证实验
验证候选基因SMCO4和FXR2对胰岛素分泌的功能影响。
在EndoC-BH1细胞中进行siRNA敲低，通过RT-qPCR验证敲低效率，并进行GSIS实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 低糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| Glutamax添加剂 | Gibco | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| 转铁蛋白 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Gibco | -- | |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| MaxGel细胞外基质 | Sigma | -- | |
| 纤维连接蛋白 | -- | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Directzol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| DNA酶I | -- | -- | |
| Bioanalyzer 2100分析仪 | Agilent | -- | |
| Nano RNA芯片 | Agilent | 5067-1511 | |
| QIAseq Fastselect RNA去除试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SMARTer链特异性总RNA样本制备试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| 细胞培养 | OPTIβ1培养基 | Human Cell Design | -- |
| OPTIβ2饥饿培养基 | Human Cell Design | -- | |
| βCoat包被基质 | Human Cell Design | -- | |
| 细胞培养与处理 | Countess 3细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siRNA转染 | 小干扰RNA | -- | -- |
| GSIS实验 | βKrebs缓冲液 | Human Cell Design | -- |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | -- | -- | |
| Mercodia人胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1113-01 | |
| RNA提取 | Invitrogen TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| Direct-zol RNA小提Plus试剂盒 | Zymo Research | R2070 | |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 11754050 |
| RT-qPCR | TaqMan Fast Advanced预混液 | Applied BioSystems | 4444556 |
| AriaMX实时荧光定量PCR系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Taqman FXR2检测 | Thermo Fisher | 4331182, | |
| Taqman SMCO4检测 | Thermo Fisher | 4351372, | |
| Taqman ACTB检测 | Thermo Fisher | 4331182, |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | EndoC-BH1细胞培养条件（培养基成分、包被基质、胰酶消化时机）、SGBS细胞分化协议 阅读提示：Methods 'Cell culture' |
| 多组学数据生成 | Promoter-focused Capture-C文库构建方法、ATAC-seq文库构建方法、RNA-seq文库构建方法、测序深度、比对参数、峰调用标准 阅读提示：Methods 'Sequencing library preparation, sequencing and analysis'、ESM Methods |
| 生物信息学分析 | GWAS数据来源、LD阈值（r2>0.8）、变异-基因映射规则、LDSC参数 阅读提示：Methods 'Bioinformatic methods' |
| 基因敲低实验 | siRNA序列及浓度、转染试剂、转染时间、细胞密度、培养时间 阅读提示：Methods 'EndoC-BH1 knockdown experiments'、ESM Methods |
| 葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验 | 细胞接种密度、siRNA处理时间、葡萄糖刺激浓度（0、20 mmol/l）、IBMX浓度（45 µmol/l）、刺激时间（40分钟）、胰岛素检测方法 阅读提示：Methods 'Glucose-stimulated insulin secretion' |