验证肠道菌群对胞葬作用的影响
确定肠道微生物群是否影响腹膜巨噬细胞胞葬作用。
小鼠给予广谱抗生素（ABX）处理7天，或使用无菌（GF）小鼠，腹腔注射凋亡细胞，检测LPMs的胞葬作用效率；并用粪菌移植（FMT）验证菌群的作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
广谱抗生素破坏稳态胞葬作用
Broad-spectrum antibiotics disrupt homeostatic efferocytosis
实验完整度
高包含体内外实验：抗生素/无菌小鼠模型、细胞实验、转录组测序（bulk和单细胞）、基因敲除小鼠、疾病模型等多层级验证。
主要模型
小鼠大腹膜巨噬细胞 骨髓来源巨噬细胞 人单核细胞来源巨噬细胞 小鼠狼疮模型（pristane诱导）
重点核对
ABX处理时间及剂量（7天，含1 g/L氨苄青霉素、1 g/L卡那霉素、0.5 g/L甲硝唑、0.5 g/L万古霉素） 丁酸处理浓度（体外1 mM；口服150 mM；腹腔40 mM） 体内胞葬作用测定（腹腔注射CypHer5E标记凋亡细胞，1小时后流式分析） ABX停药后时间点（1、7、14、21天）
摘要
凋亡细胞的清除，称为胞葬作用，对于组织稳态和预防自身免疫至关重要。尽管过去的研究已经阐明了在组织中调节稳态胞葬作用的局部分子信号，但来自远端的信号是否也调节稳态胞葬作用仍不清楚。在这里，我们表明，在广谱抗生素（ABX）处理、万古霉素处理和无菌小鼠中，大腹膜巨噬细胞（LPMs）在体内表现出受损的胞葬作用，所有这些小鼠的肠道微生物群均被耗竭。机制上，微生物群来源的短链脂肪酸丁酸直接增强小鼠和人类巨噬细胞的胞葬作用效率和容量，并在体内挽救ABX诱导的LPM胞葬作用缺陷。对丁酸处理的巨噬细胞的批量mRNA测序以及对ABX处理和丁酸挽救小鼠分离的LPMs的单细胞mRNA测序揭示了支持胞葬作用的转录程序调控。具体来说，我们发现胞葬作用受体T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含4（TIM-4，Timd4）在ABX处理小鼠的LPMs中下调，但通过口服丁酸得以恢复。我们表明，TIM-4是丁酸诱导的LPM胞葬作用容量增强所必需的，并且LPM胞葬作用在ABX停药后仍受损。ABX处理的小鼠在狼疮小鼠模型中表现出明显更严重的疾病。我们的结果表明，稳态胞葬作用依赖于远端代谢信号，并提示稳态胞葬作用缺陷可能解释ABX使用与炎症性疾病之间的联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物群来源的远端信号是否调节组织驻留巨噬细胞的稳态胞葬作用？
- 核心机制
- 微生物群来源的丁酸通过抑制HDAC3，增加组蛋白H3K27乙酰化，上调胞葬作用受体TIM-4的表达，从而增强巨噬细胞的胞葬作用容量和效率。
- 主要证据
- 抗生素处理或无菌小鼠的LPMs胞葬作用受损，FMT或丁酸补充可恢复；丁酸处理增强小鼠和人巨噬细胞胞葬作用，且TIM-4敲除消除该效应；ABX处理小鼠在狼疮模型中疾病加重。
- 研究意义
- 揭示稳态胞葬作用依赖于肠道微生物群的远端代谢信号，提示抗生素使用导致的胞葬作用缺陷可能增加炎症性疾病和自身免疫的易感性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定介导菌群效应的代谢物
测试短链脂肪酸（SCFAs）是否影响巨噬细胞胞葬作用。
在巨噬细胞分化或成熟期用丁酸、乙酸、丙酸处理，检测胞葬作用效率和容量；比较不同SCFAs的效果。
验证丁酸对胞葬作用的影响及特异性
确认丁酸增强胞葬作用的直接效应并检查其专一性。
对丁酸处理的巨噬细胞进行时间延迟共聚焦显微镜观察吞噬多个凋亡细胞的能力；检测对细菌、真菌等吞噬的影响；并在人巨噬细胞上验证。
转录组分析揭示丁酸调控的胞葬相关程序
探索丁酸增强胞葬作用的分子机制。
对丁酸处理和不处理的巨噬细胞进行bulk RNA-seq，对ABX、ABX+丁酸和对照小鼠的LPMs进行单细胞RNA-seq，分析差异表达基因和功能通路。
验证TIM-4的关键作用
验证TIM-4是否为丁酸增强LPM胞葬作用所必需。
检测ABX处理小鼠LPMs的TIM-4蛋白表达，并利用TIM-4敲除小鼠进行体内丁酸补充实验，观察胞葬作用是否还增强。
探究丁酸作用的信号通路
明确丁酸是通过GPCR还是HDAC抑制来发挥作用的。
使用GPCR（GPR109a和GPR43）敲除小鼠，检测丁酸增强胞葬作用是否依赖GPCR；使用HDAC3抑制剂RGFP966处理，检测是否模拟丁酸效应；进行ChIP-seq分析H3K27ac富集。
评估ABX停药后的持续性影响
确定ABX引起的胞葬作用缺陷是否可逆。
小鼠接受ABX处理10天后恢复正常饮水，在停药后1、7、14、21天检测LPMs胞葬作用效率和肠道菌群多样性（16S测序）。
评估ABX对自身免疫疾病模型的影响
验证ABX诱导的胞葬作用缺陷是否加剧自身免疫疾病。
ABX处理的小鼠腹腔注射pristane诱导狼疮，检测血清抗dsDNA抗体、肾脏IgG沉积和凋亡细胞清除情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 凋亡细胞标记 | CypHer5E | GE Life Sciences | PA15401 |
| 细胞标记 | CellTrace Yellow | Thermo Fisher | C34567 |
| 细胞核染色 | Hoechst | Thermo Fisher | H3570 |
| 细胞处理 | 丁酸钠 | Sigma | 303410 |
| 乙酸钠 | Sigma | S2889 | |
| HDAC3抑制 | RGFP966 | Selleck Chemicals | S7229 |
| GPCR激动剂 | 烟酸 | Sigma | N4126 |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Fisher Scientific | MT15012CV |
| RPMI-1640培养基 | Corning | 17-105-CV | |
| 细胞分离 | 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical | AN221725 |
| 单核细胞分离 | Mojosort人CD14纳米磁珠 | BioLegend | 480093 |
| 细胞因子处理 | 重组人M-CSF | PeproTech | 300-25 |
| 抗生素处理 | 卡那霉素 | -- | K4000 |
| 甲硝唑 | Sigma | M3761 | |
| 万古霉素 | BioVision | B1507 | |
| 凋亡诱导 | 地塞米松 | Sigma | -- |
| 狼疮模型诱导 | Pristane | Sigma | P2870 |
| 组织包埋 | Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek USA, Inc. | 4583 |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11001 |
| 叙利亚仓鼠抗小鼠podoplanin | BioLegend | 127401 | |
| 山羊抗叙利亚仓鼠Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 107-605-142 | |
| 凋亡检测 | 原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红色 | Roche | 12156792910 |
| 免疫荧光 | 兔抗Iba1 | Wako | 019-19741 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | |
| 流式分析 | CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-82 |
| F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | |
| TIM-4 PE-Cy7 | BioLegend | 130009 | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32728 | |
| 抗兔Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| 组蛋白乙酰化检测 | H3K9ac抗体 | Cell Signaling | 9649 |
| H3K27ac抗体 | Cell Signaling | 8173 | |
| 组蛋白甲基化检测 | H3K27me3抗体 | Cell Signaling | 9733 |
| H3K36me3抗体 | Active Motif | 61021 | |
| 组蛋白检测 | 总H3抗体 | Active Motif | 39763 |
| Western blot | 抗小鼠二抗 | Invitrogen | A32728 |
| 抗兔二抗 | Invitrogen | A32733 | |
| CUT&RUN | CUTANTA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | -- |
| 伴刀豆球蛋白A磁珠 | EpiCypher | -- | |
| 兔IgG | Antibodies Online | ABIN101961 | |
| pA/G-MNase | EpiCypher | -- | |
| CUTANA DNA纯化试剂盒 | EpiCypher | -- | |
| 文库制备 | Kapa Hyperprep试剂盒 | Roche | KK8504 |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740902.50 |
| 粪便DNA提取 | Qiagen PowerBead玻璃0.1 mm管 | Qiagen | 13118-50 |
| Promega Maxwell RSC PureFood GMO和鉴定试剂盒 | Promega | AS1600 | |
| DNA定量 | Quant-iT dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 16S文库构建 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| 16S文库验证 | PerkinElmer LabChip GXII仪器 | PerkinElmer | -- |
| 16S测序 | MiSeq试剂盒v2，500循环 | Illumina | MS-102-2003 |
| 流式细胞仪 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Scientific | -- |
| 显微镜 | Zeiss LSM 980（带Airyscan 2） | Zeiss | -- |
| 细胞系 | L929细胞 | ATCC | CCL-1 |
| Jurkat T细胞 | ATCC | TIB-152 | |
| 吞噬检测 | Alexa Fluor 594偶联酵母聚糖A | Thermo Scientific | Z23374 |
| Alexa Fluor 594偶联大肠杆菌 | Thermo Scientific | E23370 | |
| 乳胶微球 | Sigma | L3030 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内胞葬作用测定 | 小鼠品系、年龄、性别、抗生素处理时间（7天）、ABX配方（1 g/L氨苄青霉素、1 g/L卡那霉素、0.5 g/L甲硝唑、0.5 g/L万古霉素）、凋亡细胞类型和数量（1×10^6 CypHer5E标记的Jurkat细胞）、注射后时间（1小时）、LPMs门控（CD11b+F4/80hi） 阅读提示：Methods: Antibiotic treatment, In vivo efferocytosis; Figure 1a |
| 体外丁酸处理 | 丁酸浓度（1 mM）、处理时间（3天）、分化条件（7天）、凋亡细胞表面标记（CypHer5E和CellTrace Yellow）、效靶比（1:1） 阅读提示：Methods: Bone marrow-derived macrophages, In vitro efferocytosis; Figure 2a-d |
| 丁酸体内挽救 | 口服丁酸浓度（150 mM）或腹腔注射剂量（40 mM）、给药频率（每日）、给药时间（7天）、是否与ABX同时给予 阅读提示：Methods: Butyrate treatment; Figure 3a,b |
| TIM-4功能验证 | Timd4-/-小鼠品系背景、丁酸给药方案（150 mM口服）、腹腔凋亡细胞注射和LPM分析 阅读提示：Methods: Animal studies, Butyrate treatment; Figure 3e |
| 狼疮模型 | ABX处理时间（7天）、pristane剂量（500 µL/只，腹腔注射）、分析时间点（180天）、检测指标（抗dsDNA抗体、IgG沉积、TUNEL） 阅读提示：Methods: Pristane-induced lupus model; Figure 4d-f |