体外组合药物筛选
筛选与KRASG12C抑制剂具有协同抗增殖作用的药物组合
在NCI-H2122细胞中进行高内涵筛选，将adagrasib或sotorasib与179种小分子抑制剂联用，计算组合评分（cScore），验证到SOS1i、SHP2i和EGFRi等协同作用。
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共同靶向SOS1通过解决内在和获得性耐药增强KRASG12C抑制剂的抗肿瘤效果
Co-targeting SOS1 enhances the antitumor effects of KRASG12C inhibitors by addressing intrinsic and acquired resistance
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、体内CDX/PDX模型验证、耐药模型建立及机制研究（RAS-GTP检测、信号通路分析），多个独立证据层级。
主要模型
KRASG12C突变非小细胞肺癌细胞系（NCI-H2122、NCI-H358） KRASG12C突变结直肠癌细胞系（SW837） KRASG12C突变胰腺癌细胞系（MIA PaCa-2） 细胞系来源异种移植瘤模型（CDX）和患者来源异种移植瘤模型（PDX）
重点核对
细胞系：NCI-H2122、SW837、NCI-H358等，培养条件：DMEM或RPMI+10%FBS 药物浓度：adagrasib（100mg/kg体内；体外IC50），BI-3406（50mg/kg体内；体外500或1200nM） 处理时间：体外2-144小时，体内7-30天 对照组：DMSO或Vehicle（0.5%Natrosol+0.5%DMSO） 动物模型：BomTac:NMRI-Foxn1nu裸鼠、CB-17/Icr-Prkdcscid/Rj、NSG等
摘要
需要联合策略来加强和延长对KRASG12C抑制剂（KRASG12Ci）的临床反应。在这里，我们评估了KRASG12C突变肺癌和结直肠癌模型对SOS1抑制剂（SOS1i）BI-3406联合KRASG12C抑制剂adagrasib的治疗反应。我们发现，BI-3406联合adagrasib的反应强于单独使用adagrasib，与adagrasib联合SHP2（SHP2i）或EGFR抑制剂相当，并与更强地抑制RAS-MAPK信号相关。BI-3406联合adagrasib治疗还延迟了获得性耐药的出现，并对adagrasib耐药模型产生了抗肿瘤反应。对KRASG12Ci的耐药似乎由MRAS活性上调驱动，SOS1i和SHP2i均能有效抑制这种活性。敲低SHOC2（一种MRAS复合物伙伴）部分恢复了对KRASG12Ci治疗的反应。这些结果表明KRASG12C联合SOS1i是治疗KRASG12Ci初治和复发的KRASG12C突变肿瘤的一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SOS1抑制剂联合KRASG12C抑制剂能否增强抗肿瘤效果并克服或延迟耐药？
- 核心机制
- 联合治疗通过阻断SOS1介导的RAS-GTP加载，增强对KRASG12C和野生型RAS的抑制，从而更深度抑制RAS-MAPK信号；对获得性耐药，主要是通过抑制MRAS活性来实现。
- 主要证据
- 体外细胞增殖实验、RAS-GTP检测、Western blot、体内CDX/PDX模型均显示联合治疗增强抗肿瘤效果；耐药模型中MRAS上调，而SOS1i或SHP2i可抑制MRAS活性。
- 研究意义
- KRASG12C抑制剂联合SOS1抑制剂是一种有前景的治疗策略，可能对KRASG12C抑制剂初治和复发的肿瘤患者均有效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗增殖验证
验证优选组合在多种KRASG12C细胞系中的抗增殖效果
在14个KRASG12C细胞系中，用adagrasib联合BI-3406、TNO155、SHP099或cetuximab处理，评估细胞生长抑制（CGI）和Bliss加性效应。
体内药效评估
评估联合治疗在异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果
在CDX（NCI-H2122、NCI-H358、SW837）和PDX（F3008、B8032）模型中，给予单药或联合治疗，测量肿瘤体积变化并评估耐受性。
机制研究：RAS-GTP和信号通路
探索联合治疗对RAS-GTP水平和下游信号的影响
通过G-LISA和RAS-pulldown检测RAS-GTP水平，用Western blot检测p-ERK、DUSP6、cleaved PARP等。
转录组分析
分析联合治疗对基因表达和通路的影响
对xenograft肿瘤进行RNA-seq，分析差异表达基因和基因集富集分析（GSEA），计算MAPK通路活性评分（MPAS）。
获得性耐药模型建立
建立对adagrasib获得性耐药的细胞和动物模型
通过长期培养NCI-H358细胞于高剂量adagrasib建立耐药细胞系（NCI-H358R）；在SW837异种移植瘤中通过长期adagrasib治疗获得复发肿瘤。
耐药后联合治疗效果评估
评估联合治疗能否克服获得性耐药
在耐药细胞和复发肿瘤中，用adagrasib联合BI-3406、TNO155或cetuximab处理，评估细胞活力和肿瘤体积变化。
耐药机制探索
探究获得性耐药的分子机制
通过RNA-seq、Western blot和siRNA敲降等方法分析耐药细胞和肿瘤中基因表达和蛋白变化，特别是MRAS、SHOC2等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | D6429 |
| RPMI培养基 | Gibco | 3A10491-01 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30084 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-106 | |
| 细胞增殖实验 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G924C |
| 384孔板 | Greiner | 781182 | |
| 化合物添加 | Echo | Labcyte | -- |
| 细胞增殖实验 | EnVision酶标仪 | PerkinElmer | -- |
| Western blot | MSD裂解液 | Mesoscale Diagnostics | R60TX-2 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| Bradford染料 | Bio-Rad | 5000205 | |
| MOPS电泳缓冲液 | Bio-Rad | 1610788 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 1704157 | |
| Tris-甘氨酸电泳缓冲液 | Bio-Rad | 1610732 | |
| 脱脂牛奶 | Millipore | 70166 | |
| Tris缓冲盐水 | Bio-Rad | 1706435 | |
| 吐温20 | Bio-Rad | 161-0781 | |
| KRAS抗体 | LSBio | LS-C175665 | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling | 4376 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling | 9102 | |
| 磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling | 2211 | |
| DUSP6抗体 | Abcam | ab76310 | |
| cleaved PARP抗体 | Cell Signaling | 9541 | |
| cyclin D1抗体 | Biosite | ARB-Q4OL25-0,5 | |
| p27抗体 | BD | 610241 | |
| β-actin抗体 | Abcam | ab8226 | |
| Cytiva彩虹分子量标准 | Fisher Scientific | 45-001-591 | |
| 羊抗兔IgG，HRP偶联 | Dako | P0447 | |
| 羊抗小鼠IgG，HRP偶联 | Dako | P0448 | |
| ECL Western印迹检测试剂 | Amersham | RPN2106 | |
| 12% Criterion XT Bis-Tris蛋白凝胶 | Bio-Rad | 3450118 | |
| HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| MRAS抗体 | Abcam | ab176570 | |
| NRAS抗体 | Abcam | ab167136 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling | 2118 | |
| RAS-GTP检测 | KRAS孔内裂解ELISA试剂盒 | Active Motif | 52100 |
| 活性Ras拉下和检测试剂盒 | Thermo Scientific | 16117 | |
| 细胞凋亡检测 | IncuCyte caspase-3/7绿色凋亡检测试剂 | Essen BioScience | 4440 |
| 活细胞成像 | IncuCyte S3活细胞成像系统 | Essen BioScience | -- |
| siRNA转染 | 靶向SHOC2的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA双链体 | Dharmacon | L-019524-01 |
| MRAS siRNA池 | Dharmacon | L-008586-00 | |
| Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- | |
| qPCR | FastLane细胞RT-PCR_QuantiTect多重RT-PCR试剂盒 | QIAGEN | 216513 |
| MRAS TaqMan检测探针 | Thermo Fisher Scientific | Hs01031059_m1 | |
| 蛋白质检测 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 1861282 | |
| 12-230 kDa分离8x25毛细管柱 | Protein Simple | SM-W004-1 | |
| EZ标准品套装1 | Protein Simple | PS-ST01EZ-8 | |
| 抗MRas抗体（EPR12457） | Abcam | ab176570 | |
| Vimentin（D21H3）XP抗体 | Cell Signaling | 5741 | |
| E-cadherin抗体 | Abcam | ab231303 | |
| anti-actinin抗体 | Cell Signaling | 3134 | |
| 抗小鼠检测模块 | Protein Simple | DM-002 | |
| 抗兔检测模块 | Protein Simple | DM-001 | |
| 细胞培养 | 白细胞介素-3 | R&D | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 细胞增殖实验 | AlamarBlue细胞活力检测 | Thermo Fisher | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| Natrosol | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 41648 | |
| 阿达格拉西布 | MedChemExpress | -- | |
| 西妥昔单抗 | MD Anderson Cancer Center pharmacy | -- | |
| BI-3406 | Boehringer Ingelheim | -- | |
| 生物标志物分析 | 抗磷酸化p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204） | Cell Signaling Technology | 4370 |
| HLA抗体偶联Alexa 647 | Abcam | 199837 | |
| RNAscope | DUSP6探针 | Advanced Cell Diagnostics | 405361 |
| EGR1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 457671-C2 | |
| POLR2A探针 | Advanced Cell Diagnostics | 310451-C4 | |
| 免疫组化 | 抗KI-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9027 |
| 血液药物浓度检测 | 高效液相色谱系统 | Agilent | 1200 |
| Xbridge BEH C18反相色谱柱 | Waters | -- | |
| 三重四极杆质谱仪 | SCIEX | 5000 or 6500+ | |
| DNA测序 | NEB Monarch基因组DNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Illumina Truseq DNA PCR-free文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| RNA测序 | TRI裂解试剂 | QIAGEN | 79306 |
| RNAeasy小型试剂盒 | QIAGEN | 73404 | |
| QuantSeq 3' mRNA-Seq文库制备试剂盒FWD | Lexogen | 015.96 | |
| TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500测序系统 | Illumina | -- | |
| Novaseq6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | R | -- | -- |
| GraphPad Prism | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养条件 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、CO2浓度、温度 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 体外药物处理 | 药物浓度、处理时间、溶剂对照（DMSO浓度） 阅读提示：Methods: Combination studies: cell culture; Western blot; Active RAS pulldown assays |
| 体内给药 | 动物品系、性别、年龄、给药途径、剂量、频率、治疗持续时间 阅读提示：Methods: Cell line-derived efficacy studies and biomarker studies in mice; PDX studies |
| 耐药模型建立 | 长期培养条件、药物浓度、筛选标准（肿瘤体积增加） 阅读提示：Methods: Cell line-derived efficacy studies and biomarker studies in mice (resistance generation) |