胶质母细胞瘤中的颅脑功能性淋巴单位

Cranioencephalic functional lymphoid units in glioblastoma

作者信息Celia Dobersalske, Laurèl Rauschenbach, Yichao Hua, Christoph Berliner, Anita Steinbach, Anika Grüneboom, Konstantinos D Kokkaliaris, Dieter H Heiland, Pia Berger, Sarah Langer, Chin L Tan, Martin Stenzel, Somaya Landolsi, Flora Weber, Marvin Darkwah Oppong, Rudolf A Werner, Hanah Gull, Thomas Schröder, Thomas Linsenmann, Andreas K Buck, Matthias Gunzer, Martin Stuschke, Kathy Keyvani, Michael Forsting, Martin Glas, Jonathan Kipnis, Dennis A Steindler, Hans Christian Reinhardt, Edward W Green, Michael Platten, Alpaslan Tasdogan, Ken Herrmann, Florian Rambow, Igor Cima, Ulrich Sure, Björn Scheffler
PMID39085419
期刊Nat Med
发布时间2024-10
DOI10.1038/s41591-024-03152-x

实验完整度

整合临床样本、影像学、单细胞测序、流式细胞术、ELISpot、杀伤实验及生存分析等多个证据层级,并进行功能验证。

主要模型

胶质母细胞瘤患者颅骨骨髓 胶质母细胞瘤肿瘤组织 外周血单个核细胞 远端髋骨骨髓

重点核对

19例胶质母细胞瘤患者和6例Conn综合征对照的68Ga-Pentixafor PET-CT成像 颅骨、肿瘤、外周血和远端骨髓的CD45+免疫细胞单细胞RNA测序和V(D)J测序 CD8+ T细胞ELISpot检测MHC依赖性IFNγ释放,效应与靶细胞比例2:1 杀伤实验中对自体肿瘤细胞的杀伤能力,细胞比例4:1 CXCR4放射标记颅骨增强与无进展生存期的关联

摘要

脑肿瘤的生态系统被认为是免疫抑制的,但我们目前的认识可能不完整。在此,我们分析了来自胶质母细胞瘤或非恶性颅内疾病患者的临床细胞和组织标本,报告了与未经治疗的胶质母细胞瘤肿瘤相邻的颅骨骨髓在初次诊断时含有活跃的淋巴群体。临床和解剖成像、单细胞分子和免疫细胞谱分析以及肿瘤反应性量化鉴定出颅骨中的CD8+ T细胞克隆型,这些克隆型也存在于肿瘤中。这些克隆型具有急性和持久的抗肿瘤反应,根植于整个T细胞发育谱系。与远端骨髓相比,靠近肿瘤的颅骨微环境显示出表达淋巴排出标志物S1PR1的肿瘤反应性CD8+效应细胞类型频率增加。与此一致,CXCR4放射性标记的颅骨增强可能作为替代标志物,指示与改善的无进展生存期的局灶性关联。本研究的数据主张在胶质母细胞瘤的临床护理中保留并进一步开发这些颅脑单位。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
胶质母细胞瘤患者颅骨骨髓中是否存在肿瘤反应性免疫细胞及其功能意义。
核心机制
颅骨骨髓中CD8+ T细胞,特别是效应记忆T细胞,表现出肿瘤反应性并具有持久的效应功能,可能通过S1PR1介导的淋巴排出从骨髓迁移至肿瘤。
主要证据
临床影像显示胶质母细胞瘤患者颅骨CXCR4放射性标记增强;单细胞测序和流式细胞术发现颅骨中肿瘤反应性CD8+ T细胞富集;ELISpot和杀伤实验证明其抗肿瘤活性;与无进展生存期改善相关。
研究意义
揭示颅骨骨髓作为胶质母细胞瘤中肿瘤反应性T细胞的储存库,为免疫治疗和预后评估提供潜在靶点或标志物。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床影像学评估颅骨免疫细胞富集

检测胶质母细胞瘤患者颅骨中是否有免疫细胞富集。

使用68Ga-Pentixafor PET-CT成像分析19例胶质母细胞瘤患者和6例对照患者的颅骨放射性标记。

2

颅骨骨髓免疫细胞形态学分析

观察颅骨骨髓中免疫细胞的组织学分布。

对颅骨样本进行光片显微镜和免疫荧光染色,分析CD45+和CD34+细胞分布。

3

单细胞转录组和免疫组库分析

分析颅骨、肿瘤、外周血和远端骨髓中的免疫细胞组成和克隆型。

通过scRNA-seq和scVDJ测序分析CD45+细胞,鉴定免疫细胞类型和T细胞克隆共享。

4

CD8+ T细胞表型与功能验证

验证颅骨来源CD8+ T细胞的肿瘤反应性和持久性。

通过流式细胞术表型分析、ELISpot检测IFNγ释放、杀伤实验和再刺激实验评估功能。

5

预后关联分析

评估颅骨CXCR4放射标记增强与患者生存的关系。

基于临床影像数据,比较有无颅骨增强患者的无进展生存期。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
镓-68标记的Pentixafor----
Dulbecco改良Eagle培养基/F12Gibco11320033
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062
中性蛋白酶Nordmark BiochemicalsS3030112
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
REAlease CD45 (TIL) 磁珠试剂盒Miltenyi Biotec130-121-563
RPMI 1640培养基Gibco72400021
人AB血清Sigma-AldrichH5667
白细胞介素-2Peprotech200-02
白细胞介素-15Peprotech200-15
白细胞介素-21Peprotech200-21
人T细胞激活CD3/CD28/CD137 DynabeadsGibco11163D
CD8+ T细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-096-495
IFNγ ELISpot试剂盒R&D SystemsEL285,
抗HLA-DR抗体BioLegend307648
抗HLA-A/B/C抗体BioLegend311428
干扰素-γPeprotech300-02
CellTracker RedInvitrogenC34552
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249
Cytek 25色免疫分型检测Cytek BiosciencesR7-40002
ViaDye Red可固定活力染料Cytek Biosciences--
BV421-CD95抗体BioLegend305623
BV711-CD8抗体BioLegend344733
BV510-CCR7抗体BioLegend353231
APC-CD4抗体BioLegend317415
FITC-CD161抗体BioLegend339905
PE-Cy7-CD3抗体BioLegend344815
BV650-PD-1抗体BioLegend329949
BV786-CD45RA抗体BD Biosciences563870
PE-CD56抗体BD Biosciences555516
7AADInvitrogen00-6993-50
eFluor660-S1PR1抗体Thermo Fisher Scientific50-3639-42
同型对照Thermo Fisher Scientific50-4714-82
抗CD45抗体BioLegend304052
抗CD34抗体BioLegend343508
抗CD3抗体BioLegend300450
抗CD20抗体Thermo Fisher Scientific53-0202-80
DAPICarl Roth6335.1
抗CD146抗体R&D SystemsAF932
抗CXCR4抗体Thermo Fisher ScientificPA3-305
O.C.T.包埋剂Sakura4583
肉桂酸乙酯Sigma-Aldrich112372
NovaSeq 6000测序仪Illumina--
Cytek Aurora流式细胞仪Cytek Biosciences--
FACS Celesta流式细胞仪BD Biosciences--
LaVision BioTec Ultramicroscope Blaze光片显微镜Miltenyi Biotec / LaVision BioTec--
Leica TCS SP8共聚焦显微镜Leica--
Leica Stellaris 8共聚焦显微镜Leica--
β-巯基乙醇Gibco21985023

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床影像学
68Ga-Pentixafor注射活度、成像时间、患者数量
阅读提示:Methods: Clinical CXCR4 radiolabeling
样本收集与处理
组织来源、处理时间、酶消化条件
阅读提示:Methods: Tumor tissue processing, Bone sample processing
单细胞测序
10X Genomics试剂盒版本、测序平台、细胞活性阈值
阅读提示:Methods: scRNA-seq and analysis
细胞功能检测
ELISpot效应靶比例、T细胞扩增条件、IFNγ刺激浓度
阅读提示:Methods: ELISpot assays, T cell expansion
流式细胞术
抗体克隆、稀释度、仪器设置
阅读提示:Methods: Flow cytometry