DDX5 inhibits hyaline cartilage fibrosis and degradation in osteoarthritis via alternative splicing and G-quadruplex unwinding
包含临床样本分析、细胞实验、小鼠模型（DMM、MF）及体内AAV干预，并进行了机制验证（剪接调控、G4解旋）和多组学分析。
ATDC5细胞系 原代小鼠软骨细胞 Ddx5软骨细胞特异性敲除小鼠（Ddx5chon−/−） DMM诱导的OA小鼠模型 人OA软骨样本
DDX5在OA软骨中表达下调（人样本和小鼠模型） Ddx5敲除导致COL1上调、COL2下调及软骨降解 Ddx5缺失增加Fn1-AS-WT和Plod2-AS-WT转录本 DDX5直接结合Fn1和Plod2前体mRNA DDX5解开Col2启动子G4结构，且不依赖ATP
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定DDX5是否在OA进展中表达改变，并评估其与软骨纤维化的相关性。
利用RNA-seq数据（GSE114007）分析OA与非OA软骨的差异剪接事件，筛选差异表达的剪接调节因子；利用scRNA-seq数据（GSE104782）分析DDX5在COL2高和COL1高软骨细胞中的表达；收集OA患者软骨样本，通过qPCR、Western blot和免疫荧光检测DDX5表达；检测小鼠OA模型和细胞因子刺激的原代软骨细胞中DDX5表达。
确定DDX5缺失是否加重OA进展。
构建软骨细胞特异性Ddx5敲除小鼠（Ddx5chon−/−），通过DMM手术诱导OA，观察软骨损伤程度和滑膜炎评分；同时在DMM模型中通过关节腔注射AAV2-Ddx5进行过表达，评估其对OA的保护作用。
确定DDX5缺失对基因表达和蛋白表达的影响，揭示涉及的信号通路。
在ATDC5细胞中敲低Ddx5（shRNA），使用RNA-seq和TMT蛋白质组学分析差异表达基因和蛋白，并进行GO和KEGG富集分析，以及GSEA分析。
确定DDX5缺失是否导致软骨细胞纤维化表型和降解基因表达的改变。
在ATDC5细胞中敲低Ddx5后，检测COL1A1表达和细胞形态；在小鼠Ddx5chon−/−模型中，通过免疫荧光和免疫组化检测COL1A1、COL2A1、MMP13、NOS2等蛋白表达。
确定DDX5是否通过结合Fn1和Plod2前体mRNA调控其选择性剪接，并验证剪接异构体的功能。
在ATDC5细胞中敲低Ddx5后，进行rMATS分析差异剪接事件，结合临床OA数据筛选共同基因；通过RIP-PCR验证DDX5与Fn1和Plod2前体mRNA的结合；通过RT-PCR检测剪接异构体表达；在ATDC5细胞和原代软骨细胞中敲低Fn1-AS-WT和Plod2-AS-WT，通过qPCR检测纤维化和降解基因表达；在小鼠DMM模型中注射AAV2-shRNA-(Fn1+Plod2)-AS-WT，评估其对OA表型的影响。
确定DDX5是否通过解开Col2启动子G4结构上调COL2表达。
预测Col2启动子区域的G4结构，通过NMR确定其拓扑；通过ChIP验证DDX5与Col2启动子的结合；通过免疫荧光检测G4水平（BG4抗体）；通过NMR实验验证DDX5蛋白对G4的解旋活性；使用TMPyP4处理原代软骨细胞，检测COL2表达变化。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | Corning | 10-092-CVR | |
| 原代细胞分离 | II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 组织学染色 | Masson染色试剂盒 | Servicebio | G1006 |
| 番红O固绿染色试剂盒 | Solarbio | G1371 | |
| RNA提取 | TransZol Up Plus RNA试剂盒 | Transgen Biotech | ER501-01 |
| TRIzol试剂 | Takara Bio | -- | |
| 逆转录及qPCR | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| qPCR | SYBR Premix Ex Taq II试剂 | Takara Bio | -- |
| CFX 100实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| LumiGLO化学发光底物系统 | -- | -- | |
| RT-PCR | 2× Taq PCR预混液 | TIANGEN | KT201 |
| GeneAmp PCR系统9700 | Applied Biosystems | -- | |
| ChemiDoc XRS+凝胶成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RNA-seq | AMPure XP磁珠纯化系统 | Beckman Coulter | -- |
| Agilent Bioanalyzer 2100系统 | Agilent | -- | |
| featureCounts软件 | -- | -- | |
| DESeq2 R包 | -- | -- | |
| clusterProfiler R包 | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | Easy-NanoLC 1200纳升液相系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Sep-Pak tC18柱 | Waters | -- | |
| 测序级胰蛋白酶 | Hualishi | -- | |
| AAV注射 | 腺相关病毒2型 | Obio Technology | -- |
| 免疫荧光 | 抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | -- |
| 抗小鼠Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | -- | |
| Hoechst染料 | -- | -- | |
| T细胞信号放大 | 酪胺信号放大荧光试剂盒 | -- | -- |
| F-actin染色 | Vari Fluor 488-鬼笔环肽 | MedChemExpress | HY-D1817 |
| 激光共聚焦显微镜 | Zeiss LSM 880激光共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 蛋白纯化 | pMAL-MBP-DDX5-GST质粒 | General Biosystems | -- |
| 谷胱甘肽树脂 | -- | -- | |
| 直链淀粉树脂 | -- | -- | |
| 蛋白浓度测定 | One Drop OD-1000plus紫外可见分光光度计 | One Drop | -- |
| 核磁共振 | Bruker核磁共振谱仪 | Bruker | -- |
| Bruker Topspin软件 | Bruker | -- | |
| CcpNmr分析软件 | -- | -- | |
| 圆二色谱 | JASCO J-810圆二色谱仪 | JASCO | -- |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | -- |
| 基因敲低 | pCLenti-U6-shRNA(Ddx5)-CMV-Puro-WPRE质粒 | Obio Technology | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 小干扰RNA | Ruibo Bio | -- | |
| 统计分析 | Prism v.8.0.1软件 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代软骨细胞分离与培养 | 小鼠年龄（3天以内）、膝关节软骨部位、II型胶原酶浓度（0.2%）及消化时间（4小时）、培养基组成（DMEM/F-12，5% FCS，1%青霉素-链霉素） 阅读提示：Methods 中的 'Cell isolation and culture' 部分 |
| 细胞因子刺激 | IL-1β浓度（5 ng/ml）、TNF-α浓度（25 ng/ml）、刺激时间（6小时/12小时/24小时/48小时） 阅读提示：Extended Data Fig. 7 图注及 Methods 中的 'RNA-seq analysis' 和 'TMT-labeled proteomics assay' 部分 |
| Ddx5敲低 | shRNA序列（Supplementary Table 6）、敲低效率验证（qPCR和免疫印迹） 阅读提示：Methods 中的 'Gene deletion and silencing' 部分及 Supplementary Table 6 |
| Ddx5软骨细胞特异性敲除小鼠模型 | 他莫昔芬剂量（45 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）、给药天数（连续5天）、诱导开始年龄（11周龄） 阅读提示：Methods 中的 'Animal model' 部分及 Fig. 2a 图注 |
| DMM手术 | 手术方法（切断内侧半月板韧带）、术后分析时间点（6周和12周）、OARSI评分标准、滑膜炎评分标准 阅读提示：Methods 中的 'Animal model' 部分及 Fig. 2a 图注 |
| AAV2注射 | AAV2血清型（2型）、注射剂量（1.0×10^12 vg/ml，10 µl体积）、注射时间（DMM术后6周）、注射部位（关节腔） 阅读提示：Methods 中的 'AAV intra-articular injection and surgically induced OA model' 部分及 Fig. 6b 图注 |
| RIP实验 | 抗体（抗DDX5）、试剂盒（Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit） 阅读提示：Methods 中的 'Ribonucleoprotein immunoprecipitation assay and ChIP assay' 部分 |
| ChIP实验 | 抗体（抗DDX5）、试剂盒（ChIP Assay Kit）、Col2启动子区域（515-759 bp）及阴性对照区域（1470-1590 bp） 阅读提示：Methods 中的 'Ribonucleoprotein immunoprecipitation assay and ChIP assay' 部分及 Fig. 8a 图注 |
| G4解旋实验 | DDX5蛋白表达与纯化方法、NMR实验条件（温度、pH、K+浓度）、ATP存在与否对解旋的影响 阅读提示：Methods 中的 'DDX5 protein purification' 和 'NMR spectroscopy' 部分及 Fig. 8c 图注 |
| TMPyP4处理 | TMPyP4浓度（5 μM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Fig. 8f 图注及 Methods 中相关描述 |
| 组织学染色 | 切片厚度（6 μm）、SO&FG染色试剂盒（catalog no. G1371, Solarbio）、Masson染色试剂盒（catalog no. G1006, Servicebio） 阅读提示：Methods 中的 'SO&FG staining' 和 'Masson staining' 部分 |
| 免疫组化 | 抗原修复方法、封闭条件（2% BSA）、一抗孵育条件（4℃过夜）、二抗稀释比例（1:500）、信号放大试剂盒 阅读提示：Methods 中的 'IF and IHC' 部分 |
