体外药物协同作用评估
评估VEN和A1155463联合对不同淋巴瘤和白血病细胞系的杀伤效果。
使用21种细胞系和28份原代样本，通过Annexin V/PI染色检测凋亡，计算组合指数。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
阻断BCL-XL可在不依赖BIM状态的情况下克服BCL2+淋巴恶性肿瘤对维奈托克的耐药性
Blockage of BCL-XL overcomes venetoclax resistance across BCL2+ lymphoid malignancies irrespective of BIM status
实验完整度
高包含细胞系和原代样本的体外药物协同实验、基因敲除和转基因回补的功能验证、免疫沉淀机制研究，以及细胞系和患者来源异种移植模型的体内治疗实验。
主要模型
淋巴瘤和白血病细胞系：包括MCL、DLBCL、ALL等（如HBL-2、MAVER-1、JEKO-1、MINO等） 患者来源的原代淋巴瘤和白血病细胞 细胞系来源的移植瘤模型（如HBL-2、MAVER-1等） 患者来源的异种移植瘤模型（如MCL、DLBCL、B-ALL、T-ALL等）
重点核对
VEN和A1155463的浓度范围及联合给药方案 BCL-XL、BIM、BAX和BAK的表达状态 细胞系来源和患者样本类型 体内实验的给药方案（VEN 100 mg/kg口服，A1155463 10 mg/kg腹腔注射，4天用药/3天停药） CD40L共培养条件（HS5-CD40L）
摘要
维奈托克（VEN），一种B细胞淋巴瘤2（BCL2）抑制剂，在套细胞淋巴瘤（MCL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤中具有令人鼓舞的单药活性，但缓解期通常较短，这需要合理的药物联合方案。利用21种淋巴瘤和白血病细胞系以及28份原代样本，我们证明了VEN与BCL-XL抑制剂A1155463之间的强协同作用。免疫沉淀实验和对BCL-XL表达敲除或转基因表达的克隆的研究证实了其在介导固有和获得性VEN耐药中的关键作用。值得注意的是，即使在缺乏促凋亡BCL2L11/BIM表达的细胞系以及BCL2L11/BIM基因敲除的衍生物克隆中，VEN和A1155463联合也具有合成致死性。这在临床上很重要，因为BCL2L11/BIM的缺失、下调或隔离会导致VEN耐药。免疫沉淀实验进一步表明，在BIM缺陷细胞中，促凋亡效应分子BAX是VEN和A1155463作用模式的主要介质之一。最后，这种新的促凋亡联合方案在9种患者来源的淋巴瘤异种移植模型（包括MCL（n=3）、B-ALL（n=2）、T-ALL（n=1）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（n=3））中得到了体内验证。由于持续抑制BCL-XL会导致血小板减少症，我们提出并测试了一种间断的4天用药/3天停药的方案，该方案保留了预期的抗肿瘤协同作用，且血小板毒性可控。所提出的VEN和A1155463联合方案代表了一种创新的无化疗方案，在多种BCL2+血液系统恶性肿瘤中具有显著的临床前活性，且不受BCL2L11/BIM状态的影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BCL-XL抑制能否克服BCL2+淋巴恶性肿瘤对维奈托克的耐药性，且不依赖BIM状态？
- 核心机制
- BCL-XL作为BIM的缓冲蛋白，在VEN暴露后结合从BCL2释放的BIM，从而介导VEN耐药；联合抑制BCL-XL和BCL2可释放BAX和BAK，在BIM缺陷细胞中，BAX是关键效应分子。
- 主要证据
- 在21种细胞系和28份原代样本中显示VEN和A1155463协同作用；BCL-XL敲除增加VEN敏感性，回补降低敏感性；免疫沉淀显示BCL-XL隔离BIM，BAX在BIM缺陷细胞中介导协同致死性；体内实验中联合治疗在9个PDX模型和4个CDX模型中有效，包括VEN获得性耐药模型。
- 研究意义
- 该联合方案为BCL2+血液恶性肿瘤提供了一种创新的无化疗治疗策略，尤其对VEN耐药患者具有潜在价值，支持进一步开展临床试验。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BCL-XL功能验证
验证BCL-XL在介导VEN耐药中的作用。
通过CRISPR/Cas12a敲除BCL-XL，以及转基因回补，检测细胞对VEN的敏感性变化。
BIM缺陷状态下的协同致死机制研究
探究在BIM缺失时VEN和A1155463联合作用的机制。
使用BIM敲除克隆，检测VEN单药和联合用药的敏感性；通过免疫沉淀检测BCL-XL、BCL2与BAX、BAK的结合。
微环境诱导耐药模型验证
验证CD40L刺激的微环境是否通过上调BCL-XL介导VEN耐药。
将细胞与HS5-CD40L饲养层细胞共培养，检测BCL-XL表达及药物敏感性。
体内耐受模型建立及机制分析
评估VEN体内获得性耐药的特征。
将VEN敏感细胞系和PDX细胞移植到NSG小鼠，连续给予VEN直至产生耐药，分析BCL2家族蛋白表达变化。
体内联合治疗效果验证
验证VEN和A1155463联合在体内肿瘤模型中的疗效。
在多个CDX和PDX模型中，采用间断给药方案，评估肿瘤生长抑制。
血小板毒性评估
评估A1155463的间断给药方案是否降低血小板毒性。
收集小鼠血液，通过自动血细胞分析仪检测血小板计数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 维奈托克 | MedChemExpress | -- |
| A1155463 | MedChemExpress | -- | |
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 人血浆 | Macopharma | -- | |
| 基因编辑 | pX AsCpf1-Venus-NLS质粒 | -- | -- |
| pSBtet-Pur质粒 | Addgene | 60507 | |
| pCMV(CAT)T7-SB100质粒 | Addgene | 34879 | |
| pmaxGFP质粒 | -- | -- | |
| pX330重组质粒 | Addgene | 42230 | |
| 多西环素 | Duchefa Biochemie | -- | |
| 嘌呤霉素 | Serva | -- | |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素 | EXBIO | -- |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基亚砜 | Carl Roth | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| BCL-XL抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| BAK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| BIM抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| MCL1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| BCL2抗体 | BD Biosciences | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| WesternBright ECL检测试剂盒 | Advansta | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Thermo Scientific | -- |
| 正常兔IgG | EMD Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | -- |
| QuantiNova探针RT-PCR试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | Jackson Laboratory | -- |
| EDTA毛细管 | Vitrex | -- | |
| 血液分析 | BC-5300全自动血液分析仪 | Mindray | -- |
| 细胞培养 | HS5 CD40L细胞系 | -- | -- |
| 转基因表达 | pEZ-Lv197慢病毒载体 | GeneCopoeia | EX-G0117-Lv197 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养 | 培养基成分（IMDM、20%人血浆、1%青霉素/链霉素、0.4%肝素） 阅读提示：Methods: Cell lines, primary lymphoma samples, and patient-derived xenograft models |
| 基因敲除 | CRISPR/Cas12a靶向序列、电转条件、单细胞分选、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL） 阅读提示：Methods: Establishment of lymphoma cell clones with K/O of expression and transgenic re-expression of selected BCL2 genes |
| 药物处理 | VEN和A1155463的溶剂（DMSO）、浓度范围（如0.1-1000 nM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Apoptosis measurement |
| 体外协同实验 | 细胞密度、药物组合浓度矩阵、组合指数计算（CompuSyn） 阅读提示：Results: Cotargeting BCL-XL with A1155463 and BCL2 with VEN is synthetically lethal...; Methods: Apoptosis measurement |
| 体内治疗实验 | 小鼠品系（NSG）、接种细胞数（~10^7）、给药剂量（VEN 100 mg/kg口服，A1155463 10 mg/kg腹腔注射）、给药时间（第1-4天和第8-11天） 阅读提示：Methods: Experimental therapy of lymphoma-bearing mice |
| 体内耐药模型 | VEN单药给药方案（每日100 mg/kg直到耐药）、肿瘤组织采集时间（最后一次给药后24小时） 阅读提示：Methods: Experimental therapy of lymphoma-bearing mice; Results: In vivo acquired resistance... |
| 微环境耐药 | HS5-CD40L饲养层细胞共培养时间（24小时）、VEN浓度（10和100 nM） 阅读提示：Results: Microenvironmental factors are critical triggers of BCL-XL expression |
| 血小板毒性评估 | 采血时间点（4天用药后和3天停药后）、血小板计数方法（自动血液分析仪） 阅读提示：Methods: Evaluation of mouse platelet counting with an automated hematology |