JAK-STAT signaling maintains homeostasis in T cells and macrophages
研究包含多层级证据：12种JAK-STAT突变小鼠模型的转录组(RNA-seq)和表观基因组(ATAC-seq)分析，空间转录组学和RNA-FISH的体内验证，以及体外去组织背景和IFN-β刺激的功能实验，覆盖了基因表达、染色质可及性、体内验证和功能回复等多个层面。
CD8+ T细胞 巨噬细胞 脾脏组织 STAT1敲除小鼠
12种JAK-STAT突变小鼠模型（包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、IRF9、TYK2敲除及STAT1异构体、STAT5BN642H、TYK2激酶死亡突变体） 免疫细胞来源：雌性小鼠，8-12周龄，脾脏 体外培养条件：20小时，IFN-β（1000 U/ml）刺激1.5或20小时 RNA-seq和ATAC-seq数据分析方法（线性混合模型，5% FDR）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得不同JAK-STAT通路成员缺失或突变的小鼠，并分离纯化脾脏中的CD8+ T细胞、巨噬细胞等免疫细胞。
使用了12种JAK-STAT突变小鼠模型，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、IRF9、TYK2敲除，以及STAT1α-only、STAT1β-only、STAT5BN642H、TYK2K923E突变体。从小鼠脾脏中分离出CD8+ T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和B细胞。
系统描述JAK-STAT信号在稳态免疫细胞中的转录和表观遗传作用。
对分选的细胞进行RNA-seq和ATAC-seq分析，获得转录组和染色质可及性图谱。
识别受JAK-STAT调控的基因模块及其功能。
对差异表达基因进行UMAP降维和聚类，鉴定出16个基因调控模块，并进行基因集富集分析。
排除离体操作的影响，验证稳态JAK-STAT信号是否在体内真实存在。
使用空间转录组学（Visium）和RNA-FISH技术，在未经细胞分离的脾脏组织中检测JAK-STAT靶基因的表达。
测试JAK-STAT信号是否依赖于体内组织环境。
将野生型T细胞和巨噬细胞在体外培养20小时，并用IFN-β刺激，评估转录组变化。
评估IFN-β刺激能否恢复JAK-STAT突变细胞中受影响的基因表达。
对JAK-STAT突变细胞进行体外培养和IFN-β刺激，比较其与野生型细胞的转录组反应。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与刺激 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI培养基 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 重组小鼠IFN-β | PBL Assay Science | 12401-1 | |
| 重组小鼠IL-2 | PeproTech | 212-12 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-02 | |
| 细胞分选 | 红细胞裂解液 | Promega | Z3141 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | -- | |
| 泛树突状细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-875 | |
| 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | -- | |
| RNA-seq | Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| SPRI磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 空间转录组学 | Visium FFPE空间基因表达玻片 | 10X Genomics | -- |
| RNA-FISH | RNAscope多重荧光检测试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| 探针：Mm-Oas3 | -- | 1054261-C2 | |
| 探针：Mm-Ifit3 | -- | 508251-C2 | |
| 探针：Mm-Cd3e | -- | 314721-C3 | |
| Opal650荧光染料 | Perkin Elmer | -- | |
| ATAC-seq | 转座酶TDE1 | Illumina | -- |
| NP-40 | Sigma | -- | |
| 洋地黄皂苷 | Promega | -- | |
| MinElute试剂盒 | -- | -- | |
| 核酸提取 | AllPrep RNA/DNA微量提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| 流式细胞术 | BD FACS-Aria III Fusion流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 空间转录组学 | 樱花组织处理机VIP 6 AI | Sakura | -- |
| 赛默飞组织包埋工作站HistoStar | Thermo Scientific | -- | |
| 赛默飞轮转式切片机HM 355S | Thermo Scientific | -- | |
| RNA-FISH | 尼康Eclipse Ti2-E/横河CSU-W1转盘共聚焦显微镜 | NIKON | -- |
| ATAC-seq | Qubit荧光计 | Life Technologies | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与免疫细胞分离 | 小鼠品系、年龄、性别、饲养条件、具体基因型及构建方式、细胞分选方案 阅读提示：Methods: Mouse models, Immune cell isolation and purification |
| 转录组和表观基因组分析 | RNA-seq和ATAC-seq的文库制备方法、测序平台、数据分析参数（比对、定量、差异分析模型） 阅读提示：Methods: Transcriptome profiling with Smart-seq2, Epigenome profiling with ATAC-seq, Processing and quality control of the RNA-seq data, Processing and quality control of the ATAC-seq data |
| 体外去组织背景和IFN-β刺激实验 | 培养时间、刺激物种类、浓度、刺激时间点 阅读提示：Methods: Ex vivo immune cell culture and stimulation |
| 体内验证实验 | 组织固定方法（灌注固定）、空间转录组学流程、RNA-FISH探针和流程 阅读提示：Methods: Spatial transcriptomics, Single-molecule RNA-FISH |
