样本制备与抗体滴定
建立针对骨髓造血祖细胞的最优CITE-seq抗体组合
从4名健康供者（非洲和欧洲血统）获取骨髓，分离BMNCs、CD34+细胞和CD34+CD271+细胞，用266种TotalSeq-A抗体进行5个浓度梯度滴定，并通过机器学习和多级阈值筛选出132种抗体。
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人类造血祖细胞的免疫表型耦合转录组图谱
An immunophenotype-coupled transcriptomic atlas of human hematopoietic progenitors
实验完整度
高包含体外细胞实验（CITE-seq、流式细胞术、集落形成实验）、多供者样本分析、功能验证（c.f.u.测定）及AML样品验证，多个独立证据层级。
主要模型
人骨髓单个核细胞（BMNCs） CD34+造血干细胞/祖细胞 CD271+基质细胞 AML患者骨髓样本
重点核对
抗体滴定浓度（0.25×至4×） 供者种族和性别多样性 CITE-seq与Infinity Flow技术间标记物一致性 C5L2/TSPAN33标记粒细胞祖细胞 CD133区分MEP亚群
摘要
对人类造血祖细胞区的分析正在被单细胞多模态方法所改变。通过测序的转录组和表位的细胞索引（CITE-seq）能够实现表面蛋白和转录组的耦合分析，从而揭示祖细胞状态背后的基因组程序。为了系统地对原代人骨髓细胞进行CITE-seq分析，我们使用266种CITE-seq抗体（抗体衍生标签）的滴定和机器学习来优化一个132种抗体的组合。多模态分析解析了超过80种由独特表面标记和转录组定义的干细胞、祖细胞、免疫细胞、基质细胞和过渡态细胞。该数据集能够为计算机预测的细胞状态提供流式细胞术方案，并识别出数十种在不同种族和性别供者中一致检测到的细胞表面标志物。最后，通过对齐该图谱的注释，我们为急性髓系白血病干细胞群体指定了正常的骨髓对应物，这些群体在临床反应上存在差异。该图谱作为人类健康与疾病中造血祖细胞分析的高级数字资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何整合免疫表型与转录组信息，解析人类骨髓造血祖细胞的异质性和过渡态？
- 核心机制
- 造血分化呈现离散的祖细胞状态，而非完全连续的过程，这些状态对应特定的表面蛋白组合和转录程序。
- 主要证据
- 通过CITE-seq获得超过30万单细胞转录组和表面蛋白数据，结合scTriangulate整合聚类，鉴定出85-89个细胞状态，并通过流式分选和集落形成实验验证了新标志物（如C5L2/TSPAN33、CD133、CD326/CD235a）的功能。
- 研究意义
- 提供了一份人类骨髓造血祖细胞的多模态参考图谱，可用于新细胞表面标志物的发现、细胞分选策略的优化，以及白血病干细胞起源的研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CITE-seq数据生成与质控
获得高分辨率单细胞转录组和表面蛋白数据
使用10x Chromium平台进行CITE-seq，采用HTO标记区分样本和浓度，经Cell Ranger和SoupX处理，滤除低质量细胞。
数据整合与聚类
整合转录组和表面蛋白数据，解析细胞状态
使用scTriangulate整合来自细胞注释、无监督聚类和WNN聚类的结果，最终获得89个整合簇，并注释细胞类型。
标志物验证
验证CITE-seq预测的表面标志物在流式细胞术中的适用性
使用Infinity Flow和常规流式分选验证C5L2/TSPAN33、CD133、CD326/CD235a等标志物，并通过细胞形态学和集落形成实验评估其功能。
跨技术一致性分析
评估表面标志物在不同供者和技术间的稳定性
对4个供者的CITE-seq和Infinity Flow数据应用cyCombine批量校正，结合Anderson-Darling检验和专家评审，确定跨技术和供者一致的标志物。
AML样本映射与差异分析
利用健康图谱解析白血病干细胞(LSC)的起源和标志物
将AML CITE-seq数据（来自Pei et al.）映射到本图谱，比较p-LSC和m-LSC样本的细胞频率和表面蛋白表达差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本处理与细胞分离
流式细胞术与分选
批量效应校正
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本制备 | Ficoll Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 |
| SepMate-50管 | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| 细胞分选 | Sony MA900细胞分选仪 | Sony Biotechnology | -- |
| 样本制备 | CD34磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-046-701 |
| autoMACS分离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD271磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-099-023 | |
| 单细胞测序 | 10x Chromium X 3' 版本3.1 HT试剂盒 | 10x Genomics | 1000370 |
| 10x Chromium标准3'版本3.1试剂盒 | 10x Genomics | 1000268 | |
| TotalSeq-A抗体 | BioLegend | PN 900006213, PN 900003129, 399907 | |
| 文库制备 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 |
| 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | G2939BA | |
| KAPA HiFi文库定量试剂盒 | Roche | KK4824 | |
| 流式细胞术 | Cytek Aurora全光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- |
| Laminar Wash MINI系统 | Curiox Biosystems | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria II | BD Biosciences | -- |
| 功能验证 | MegaCult-C培养基加脂质 | STEMCELL Technologies | 04850 |
| 重组人促红细胞生成素 | -- | -- | |
| 重组人白细胞介素-3 | -- | -- | |
| 重组人白细胞介素-6 | -- | -- | |
| 重组人干细胞因子 | -- | -- | |
| 重组人血小板生成素 | -- | -- | |
| 重组人粒细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 重组人巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 胶原溶液 | STEMCELL Technologies | 04902 | |
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Gibco | 21056023 |
| BIT 9500 | STEMCELL Technologies | 09500 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 人低密度脂蛋白 | STEMCELL Technologies | 02698 | |
| 流式细胞术 | PharmLyse红细胞裂解液 | BD Biosciences | 555899 |
| 细胞分选 | CD71-PE抗体 | BioLegend | 334105 |
| CD326-APC抗体 | BioLegend | 324207 | |
| CD235a-BV421抗体 | BioLegend | 349131 | |
| CD71-FITC抗体 | BioLegend | 334103 | |
| CD326-APC抗体（克隆9C4） | BioLegend | -- | |
| CD235a-BV421抗体（克隆HI264） | BioLegend | -- | |
| 形态学 | Differential Quik III染色液 | Polysciences | -- |
| Camco染色套装 | Cambridge Diagnostic Products | 702 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集与制备 | 供者骨髓来源、体积（100ml或25ml）、Ficoll密度梯度离心条件、CD34和CD271磁珠分选程序 阅读提示：Methods：Sample preparation for CITE-seq |
| 抗体滴定 | TotalSeq-A抗体滴度（0.25×至4×）、细胞数（500,000cells/50μl）、染色时间（30min,4°C） 阅读提示：Methods：TotalSeq-A antibodies 和 ADT marker nomination |
| CITE-seq文库制备与测序 | 10x Chromium平台（HT或标准）、每孔细胞数（97,000-115,000或16,000）、测序设定（PE150+10+10等） 阅读提示：Methods：Single-cell CITE-seq generation 和 Library preparation and sequencing |
| 数据质控与标准化 | HTO去多重、SoupX污染率（15%）、细胞过滤参数（nFeature_RNA>500等）、TotalVI标准化 阅读提示：Methods：HTO calling and quality control 和 CITE-seq analysis |
| Infinity Flow数据生成 | Cytek Aurora设置、面板（22色主干）、抗体浓度滴定（1:25至1:400）、清洗参数（15cycles, 10μl/s） 阅读提示：Methods：PE antibody titration 和 Infinity Flow data generation |
| 跨技术整合 | cyCombine参数（seed=840, xdim=8, ydim=8等）、CITE-seq和Infinity Flow的共同供者样本 阅读提示：Methods：Batch effect correction by cyCombine |
| 功能验证 | c.f.u.测定培养基成分、细胞因子浓度（rhEPO 3U/ml等）、培养时间（1-2周）、染色抗体组合 阅读提示：Methods：Cell sorting for TSPAN33+C5L2+ cells and bulk culture c.f.u. assays, 以及 MEP相关c.f.u.测定 |