开发无白蛋白的示踪剂配方
建立一种不含白蛋白的[U-13C]棕榈酸溶液,以便在不改变白蛋白水平的情况下测量FFA通量。
测试了PVP、DMSO和乙醇等辅料,最终确定0.2% PVP和25% DMSO的水溶液能溶解1.5 mM棕榈酸。
Albumin is an important factor in the control of serum free fatty acid flux in both male and female mice
包含体内示踪剂动力学实验、基因表达分析和蛋白质磷酸化检测,多个层级验证。
雄性C57BL/6N小鼠 雄性和雌性白蛋白敲除(Alb−/−)小鼠 野生型(WT)同窝小鼠
白蛋白敲除小鼠及野生型同窝小鼠的品系和性别 示踪剂配方(白蛋白配方或PVP/DMSO配方) 给药剂量和途径(5 mL/kg,尾静脉注射) 禁食时间(16小时) 样本量(n=4-9/组)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立一种不含白蛋白的[U-13C]棕榈酸溶液,以便在不改变白蛋白水平的情况下测量FFA通量。
测试了PVP、DMSO和乙醇等辅料,最终确定0.2% PVP和25% DMSO的水溶液能溶解1.5 mM棕榈酸。
验证无白蛋白的PVP/DMSO配方与传统白蛋白配方在测量FFA通量方面是否等效。
对8周龄雄性C57BL/6N小鼠分别注射白蛋白配方或PVP/DMSO配方的示踪剂,测量血液动力学指标和FFA通量。
测定白蛋白缺乏对血清FFA通量及通量与浓度关系的影响。
使用PVP/DMSO配方,对8周龄雄性和雌性Alb−/−及WT小鼠进行同样的动力学实验。
探究低FFA通量是否与脂肪分解调节有关。
通过RT-PCR检测Atgl和Cd36 mRNA表达,通过Western blot检测HSL磷酸化水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 示踪剂配制 | 无脂肪酸人血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3782 |
| [U-13C]棕榈酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-409 | |
| 二甲基亚砜(DMSO) | Bio-Techne | 3176 | |
| 血液采集 | EZ读数器微量血细胞比容卡 | LW Scientific | ZCP-EZRD-HEM7 |
| 血清FFA浓度分析 | 液相色谱-质谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| LC-MS分析 | C18色谱柱 | Agilent Technologies | 959757-902 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| cDNA合成 | cDNA合成试剂盒 | Agilent Technologies | 600559 |
| RT-PCR | Atgl TaqMan引物/探针 | Thermo Scientific | Mm00503040_m1 |
| Cd36 TaqMan引物/探针 | Thermo Scientific | Mm00432403_m1 | |
| 18S TaqMan引物/探针 | Thermo Scientific | Hs99999901_s1 | |
| 蛋白提取 | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | 78420 | |
| Western blot样品制备 | 样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610737 |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Western blot转膜 | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1620167 |
| Western blot封闭 | 脱脂奶粉 | LabScientific | M0841 |
| Western blot | TBS缓冲液 | Bio-Rad | 1706435 |
| 吐温20 | Bio-Rad | 1706531 | |
| Western blot抗体孵育 | p-HSLSer563抗体 | Cell Signaling Technology | 4139 |
| HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 4107 | |
| αβ-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Western blot二抗 | 二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Western blot检测 | LI-COR Odyssey Clx成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| 统计分析 | JMP Pro | SAS Institute | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物饲养与准备 | 小鼠品系、性别、年龄、禁食时间 阅读提示:Animals节 |
| 示踪剂配制 | 白蛋白配方或PVP/DMSO配方、示踪剂浓度 阅读提示:[U-13C]Palmitic Acid Preparation节 |
| 给药与采样 | 给药剂量、途径、时间点 阅读提示:Experimental Procedure节 |
| FFA浓度和动力学计算 | 血清体积假设、计算方程 阅读提示:Serum FFA Flux Calculations节 |
| 基因表达和蛋白检测 | 组织来源、RNA/蛋白提取方法、抗体信息 阅读提示:Real Time PCR和Western Blot节 |