白蛋白是雄性和雌性小鼠血清游离脂肪酸通量的重要调控因子

Albumin is an important factor in the control of serum free fatty acid flux in both male and female mice

作者信息Keigo Tomoo, Mirandia Szramowski, Rodolfo Pinal, Juliauna M Meyer, Yi Zhang, Laura E Murray-Kolb, Gregory C Henderson
PMID38482577
发布时间2024-05-01
DOI10.1152/japplphysiol.00894.2023

实验完整度

包含体内示踪剂动力学实验、基因表达分析和蛋白质磷酸化检测,多个层级验证。

主要模型

雄性C57BL/6N小鼠 雄性和雌性白蛋白敲除(Alb−/−)小鼠 野生型(WT)同窝小鼠

重点核对

白蛋白敲除小鼠及野生型同窝小鼠的品系和性别 示踪剂配方(白蛋白配方或PVP/DMSO配方) 给药剂量和途径(5 mL/kg,尾静脉注射) 禁食时间(16小时) 样本量(n=4-9/组)

摘要

白蛋白敲除(Alb−/−)小鼠表现出低血浆游离脂肪酸(FFA)浓度,但尚不清楚这种抑制的浓度是否反映了FFA在循环中出现的速率(即FFA通量)较低,或者白蛋白的缺失是否改变了FFA通量与浓度之间的关系。为了理解白蛋白在FFA通过血液运输中的作用,仅依赖FFA浓度数据是不够的。因此,我们开发了一种在Alb−/−小鼠中研究FFA动力学的方法。使用无白蛋白的[U-13C]棕榈酸示踪剂配方,对Alb−/−和野生型(WT)小鼠的血清FFA动力学进行了测试。结果表明,Alb−/−小鼠血清中FFA的通量显著低于WT小鼠(P < 0.05),而白蛋白缺乏并未改变FFA通量与浓度之间的关系。接下来,为了测试抑制的脂肪分解是否也可能参与了抑制的FFA动力学,我们检测了脂肪组织中脂肪分解酶(脂肪甘油三酯脂肪酶,Atgl)的基因表达和脂肪分解的标志物(激素敏感性脂肪酶的磷酸化,p-HSL)。与Alb−/−中低的FFA通量相反,Alb−/−小鼠脂肪组织中Atgl基因表达和p-HSL蛋白均显著高于WT小鼠(P < 0.05)。因此,Alb−/−中低的FFA通量似乎是由白蛋白的FFA结合功能缺失所驱动,而非通过调节脂肪分解,表明白蛋白是决定循环中FFA通量的重要因素。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
白蛋白缺乏是否影响血清游离脂肪酸(FFA)的通量,以及这种影响是否独立于脂肪分解调节?
核心机制
白蛋白通过其FFA结合功能促进FFA从脂肪组织释放入血,决定了血清FFA通量,而脂肪分解的调节并非主要因素。
主要证据
使用无白蛋白的示踪剂配方,发现Alb−/−小鼠血清FFA通量低于WT,且白蛋白缺乏时FFA通量与浓度关系不变;同时WAT中Atgl和p-HSL升高,表明脂肪分解未被抑制。
研究意义
证实白蛋白是血清FFA通量的重要决定因素,为理解白蛋白在脂质代谢中的作用提供基础,可能对低白蛋白血症相关代谢紊乱的研究有重要意义。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

开发无白蛋白的示踪剂配方

建立一种不含白蛋白的[U-13C]棕榈酸溶液,以便在不改变白蛋白水平的情况下测量FFA通量。

测试了PVP、DMSO和乙醇等辅料,最终确定0.2% PVP和25% DMSO的水溶液能溶解1.5 mM棕榈酸。

2

比较两种配方在野生型小鼠中的FFA动力学

验证无白蛋白的PVP/DMSO配方与传统白蛋白配方在测量FFA通量方面是否等效。

对8周龄雄性C57BL/6N小鼠分别注射白蛋白配方或PVP/DMSO配方的示踪剂,测量血液动力学指标和FFA通量。

3

比较Alb−/−和WT小鼠的FFA动力学

测定白蛋白缺乏对血清FFA通量及通量与浓度关系的影响。

使用PVP/DMSO配方,对8周龄雄性和雌性Alb−/−及WT小鼠进行同样的动力学实验。

4

检测脂肪组织中脂肪分解标志物

探究低FFA通量是否与脂肪分解调节有关。

通过RT-PCR检测Atgl和Cd36 mRNA表达,通过Western blot检测HSL磷酸化水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
无脂肪酸人血清白蛋白Sigma-AldrichA3782
[U-13C]棕榈酸Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-409
二甲基亚砜(DMSO)Bio-Techne3176
EZ读数器微量血细胞比容卡LW ScientificZCP-EZRD-HEM7
液相色谱-质谱系统Agilent Technologies--
C18色谱柱Agilent Technologies959757-902
TRIzol试剂Invitrogen15596018
RNA提取试剂盒Qiagen74104
cDNA合成试剂盒Agilent Technologies600559
Atgl TaqMan引物/探针Thermo ScientificMm00503040_m1
Cd36 TaqMan引物/探针Thermo ScientificMm00432403_m1
18S TaqMan引物/探针Thermo ScientificHs99999901_s1
细胞裂解液Cell Signaling Technology9803
蛋白酶抑制剂Roche11836170001
磷酸酶抑制剂Thermo Scientific78420
样品缓冲液Bio-Rad1610737
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
硝酸纤维素膜Bio-Rad1620167
脱脂奶粉LabScientificM0841
TBS缓冲液Bio-Rad1706435
吐温20Bio-Rad1706531
p-HSLSer563抗体Cell Signaling Technology4139
HSL抗体Cell Signaling Technology4107
αβ-微管蛋白抗体Cell Signaling Technology--
二抗LI-COR Biosciences926-32211
LI-COR Odyssey Clx成像系统LI-COR Biosciences--
JMP ProSAS Institute--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物饲养与准备
小鼠品系、性别、年龄、禁食时间
阅读提示:Animals节
示踪剂配制
白蛋白配方或PVP/DMSO配方、示踪剂浓度
阅读提示:[U-13C]Palmitic Acid Preparation节
给药与采样
给药剂量、途径、时间点
阅读提示:Experimental Procedure节
FFA浓度和动力学计算
血清体积假设、计算方程
阅读提示:Serum FFA Flux Calculations节
基因表达和蛋白检测
组织来源、RNA/蛋白提取方法、抗体信息
阅读提示:Real Time PCR和Western Blot节