慢病毒转导优化
在类器官培养中高效转导原代上皮细胞，实现高MOI及多拷贝整合。
将原代小鼠膀胱尿路上皮细胞（mBU）和前列腺上皮细胞（mPE）与浓缩慢病毒在Matrigel中混合培养，检测转导效率和病毒拷贝数。
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探索癌症中复杂基因型-表型关联的组合遗传策略
A combinatorial genetic strategy for exploring complex genotype-phenotype associations in cancer
实验完整度
高包含体外类器官培养、体内移植瘤模型、单细胞测序及RNA-seq等多层级实验，并进行功能验证和机制探索。
主要模型
小鼠膀胱尿路上皮细胞（mBU）类器官 小鼠前列腺上皮细胞（mPE）类器官 NSG小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
慢病毒文库的MOI及每个细胞的病毒拷贝数 shRNA敲低效率验证（qPCR） 肿瘤形成效率（80%和38%）及潜伏期 单细胞条形码测序识别克隆组成 组织学亚型与克隆关联的LCM验证
摘要
现有基因定义的癌症模型在基因型和表型复杂性方面有限，且不能充分代表人类癌症的异质性。在此，我们描述了一种组合遗传策略，应用于类器官转化实验，以快速生成多样化、临床相关的膀胱癌和前列腺癌模型。重要的是，所得肿瘤的克隆结构可通过单细胞或空间分辨的下一代测序来解析，以揭示癌症表型的多基因驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何快速生成基因型和表型多样化的癌症模型，并解析复杂基因型与表型之间的关联？
- 核心机制
- 文献明确提出了Fgfr3激活突变与膀胱癌乳头状尿路上皮癌分化相关，Kmt2c缺失与前列腺癌多形性巨细胞癌相关，但未明确具体分子通路。
- 主要证据
- 通过类器官转化实验和单细胞条形码测序，在FHBT模型中将Fgfr3 S243C与乳头状尿路上皮癌、shKmt2c与多形性巨细胞癌关联。
- 研究意义
- 该方法提供了研究癌症中高阶遗传相互作用的原理验证，有望用于探索复杂的基因型-表型关系。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建条形码慢病毒文库
构建编码癌症相关基因改变（过表达或敲低）的条形码慢病毒文库，用于组合遗传研究。
选择膀胱癌和前列腺癌中常见突变基因，克隆ORF或shRNA到双条形码慢病毒载体，生产并浓缩文库。
类器官转化实验
通过体内移植选择肿瘤形成克隆，研究组合遗传事件对肿瘤发生的影响。
将转导后的类器官与胚胎间充质重组，皮下移植到NSG小鼠，评估肿瘤形成能力。
克隆结构解析
识别肿瘤中的克隆组成及与组织学亚型的关联。
使用单细胞DNA扩增子测序（Mission Bio Tapestri）对肿瘤细胞进行条形码分析，结合激光显微切割和bulk测序关联克隆与组织学区域。
分子表型分析
验证模型的临床相关性并比较肿瘤亚型的转录组特征。
通过RNA-seq分析FHBT模型的转录组，使用PCA、BASE47和Consensus Molecular Classifier进行分类，并与TCGA-BLCA数据比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转导 | 基质胶 | Corning | -- |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- | |
| RNeasy小量RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SuperScript IV逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green qPCR预混液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| GeneJET基因组DNA纯化试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| TaqMan拷贝数参考检测（小鼠Tfrc） | ThermoFisher Scientific | 4458366 | |
| EGFP TaqMan拷贝数检测 | ThermoFisher Scientific | Mr00660654_cn | |
| 分散酶 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 单细胞测序 | Mission Bio Tapestri单细胞DNA定制试剂盒 | Mission Bio | -- |
| KAPA纯化磁珠 | Roche Molecular Systems | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Agilent TapeStation | Agilent | -- | |
| 激光显微切割 | Arcturus XT激光捕获显微切割系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
| GeneRead DNA FFPE提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RNeasy FFPE RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Wizard SV凝胶及PCR纯化系统 | Promega | -- | |
| RNA-seq | SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒v3（Pico输入哺乳动物） | Takara Bio | -- |
| 免疫组化 | 抗广谱细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab9377 |
| 兔单克隆GFP抗体 | Cell Signaling | clone D5.1 | |
| 兔多克隆p63抗体 | Proteintech | 12143-1-AP | |
| 小鼠单克隆p53抗体 | Cell Signaling | clone 1C12 | |
| 兔单克隆HOXB13抗体 | Cell Signaling | clone D7N8O | |
| 兔多克隆AR抗体 | Millipore | 06-680 | |
| 兔单克隆GATA3抗体 | Cell Signaling | clone D13C9 | |
| 兔单克隆CD44抗体 | Cell Signaling | clone E7K2Y | |
| 流式分选 | 人/小鼠/牛整合素α6/CD49f PE偶联抗体 | R&D Systems | FAB13501P |
| PE/Cyanine7抗小鼠CD326 (Ep-CAM)抗体 | BioLegend | 118216 | |
| CD31 (PECAM-1)单克隆抗体(390), FITC | eBioscience | 11-0311-82 | |
| CD45单克隆抗体(30-F11), FITC | eBioscience | 11-0451-85 | |
| TER-119单克隆抗体(TER-119), FITC | eBioscience | 11-5921-82 | |
| 动物实验 | 睾酮缓释片 | Innovative Research of America | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代细胞分离与类器官培养 | 细胞来源（8-12周龄雄性C57BL/6小鼠）、分选标志物（Lin-CD49fhighEpCAMhigh）、培养条件（Matrigel基质胶，培养基成分等） 阅读提示：Methods 中“Mouse bladder and prostate dissociation and organoid culture”部分 |
| 慢病毒转导与文库构建 | 慢病毒载体构建（双条形码）、转导效率（MOI及拷贝数）、shRNA筛选（3-5条TRC序列） 阅读提示：Methods 中“Lentiviral constructs and lentiviral library production”和“shRNA screening”部分 |
| 体内移植瘤模型 | 间充质来源（E16膀胱或尿生殖窦）、移植数量（1-2万细胞）、小鼠品系（NSG）、肿瘤收集标准（1cm） 阅读提示：Methods 中“Organoid transformation assay”部分 |
| 单细胞条形码分析 | Tapestri平台、样本制备（细胞数）、测序参数 阅读提示：Methods 中“Single-cell DNA amplicon sequencing library preparation and sequencing”部分 |
| 转录组分析 | RNA-seq流程、数据归一化、分类器（BASE47, ConsensusMIBC） 阅读提示：Methods 中“Transcriptional subtype analysis and PCA projections”部分 |