lncRNA注释与进化分析
建立跨物种lncRNA数据集并评估其序列保守性。
收集六种脊椎动物的RNA-seq数据，组装转录本，用CPAT筛选lncRNA，将注释与公共数据库合并。通过BLAST分析序列相似性，计算Jaccard指数。
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计算预测与实验验证鉴定从斑马鱼到人类的功能保守长链非编码RNA
Computational prediction and experimental validation identify functionally conserved lncRNAs from zebrafish to human
实验完整度
高包含计算预测、CRISPR-Cas12a筛选、体外细胞增殖验证、斑马鱼胚胎敲低救援、小鼠异种移植模型及RNA pull-down/MS互作组分析等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
HeLa细胞 Huh7细胞 MCF7细胞 斑马鱼胚胎 小鼠异种移植模型
重点核对
CRISPR-Cas12a介导的lncRNA基因敲除效率（通过基因组PCR和RT-qPCR验证） shRNA敲低效率及对细胞增殖的影响（IncuCyte和流式检测） 斑马鱼胚胎中ASO敲低效率及发育表型（4 hpf形态和基因表达） RNA pull-down实验中RBP结合位点突变对救援功能的影响（如NONO位点） 异种移植实验中DOX诱导的异位表达及肿瘤生长差异
摘要
长链非编码RNA（lncRNAs）的功能研究一直受到缺乏评估其进化方法的阻碍。在这里，我们提出了lncRNA同源探索器（lncHOME），一种计算流程，用于鉴定具有保守基因组位置和RNA结合蛋白（RBP）结合位点模式的一类独特的长链非编码RNA（coPARSE-lncRNAs）。值得注意的是，数百个人类coPARSE-lncRNAs可以进化追溯到斑马鱼。使用CRISPR–Cas12a敲除和救援实验，我们发现敲除许多人类coPARSE-lncRNAs导致细胞增殖缺陷，随后这些缺陷被预测的斑马鱼同源物所拯救。在斑马鱼胚胎中敲低coPARSE-lncRNAs导致严重的发育延迟，这些延迟被人同源物拯救。此外，我们验证了人类、小鼠和斑马鱼coPARSE-lncRNA同源物倾向于结合相似的RBPs，其保守功能依赖于特定的RBP结合位点。总的来说，我们的研究展示了一种研究lncRNA功能保守性的综合方法，并暗示众多lncRNA在调节脊椎动物生理学中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺乏序列保守性的lncRNAs如何跨物种实现功能保守，以及如何系统鉴定这类功能保守的lncRNAs？
- 核心机制
- coPARSE-lncRNAs通过保守的RBP结合位点与特定RBPs相互作用，从而维持跨物种的保守功能。
- 主要证据
- CRISPR-Cas12a筛选和敲除救援实验显示人类coPARSE-lncRNAs敲除导致增殖缺陷，可被斑马鱼同源物救援；斑马鱼胚胎敲低相应同源物导致发育延迟，可被人同源物救援；RNA pull-down-MS分析显示同源物结合相似的蛋白质组。
- 研究意义
- 本研究提供了跨脊椎动物保守lncRNAs的资源，揭示了lncRNA功能进化的机制，并为研究lncRNA保守功能提供了方法框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于同线性和RBP结合位点模式的同源预测
利用同线性和RBP结合位点模式预测跨物种的lncRNA同源物。
开发随机森林模型利用同线性指标预测同源候选；构建RBP结合基序库，计算MPSS和GPS，以排列检验筛选coPARSE-lncRNAs。
CRISPR-Cas12a敲除筛选
功能表征coPARSE-lncRNAs，鉴定促进细胞增殖的lncRNAs。
设计并构建配对crRNA文库，在三种癌细胞系中感染表达Cas12a的细胞，通过FACS分选，在多个时间点收集细胞，提取基因组DNA进行高通量测序，分析crRNA丰度变化。
敲除-救援验证
验证预测的同源lncRNA在功能上能够互补，即人类lncRNA敲除可被斑马鱼同源物救援。
构建含crRNA和可诱导表达同源物的慢病毒载体，感染Cas12a稳定表达的HeLa细胞，分为Dox+/-组，通过IncuCyte检测细胞增殖变化，并统计救援效果。
斑马鱼胚胎敲低救援实验
在体内验证lncRNA同源物的功能保守性。
在斑马鱼胚胎中注射ASO敲低内源lncRNA，同时注射人同源物RNA（有义或反义）进行救援，观察胚胎发育表型。
异种移植肿瘤模型
在体内评估lncRNA RP1-212P9.3及其斑马鱼同源物对肿瘤生长的影响。
将敲除RP1-212P9.3并表达救援片段（人、斑马鱼或荧光素酶对照）的HeLa细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠，监测肿瘤生长，31天后处死称重。
RBP互作组分析
验证coPARSE-lncRNA同源物与相似RBPs相互作用。
对lncRNA片段进行体外RNA pull-down，结合MS鉴定互作蛋白，并进行免疫印迹验证关键RBPs。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
CRISPR-Cas12a敲除筛选
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清（FBS） | BI | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 药物处理 | 多西环素 | Selleck | -- |
| 细胞培养 | Leibovitz's L-15培养基 | Gibco | -- |
| DEEM培养基 | Gibco | -- | |
| F12培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 质粒构建 | psWLV载体 | Addgene | -- |
| Gibson组装试剂盒 | TransGen Biotech | -- | |
| 细胞系构建 | Cas12a-T2A-mCherry载体 | Addgene | -- |
| 文库构建 | CustomArray合成服务 | -- | -- |
| Gibson克隆试剂盒 | TransGen Biotech | -- | |
| trans-T1感受态细胞 | TransGen Biotech | -- | |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | CWbio | -- | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | -- | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | -- | |
| jetPRIME DNA转染试剂 | Polyplus-transfection | -- | |
| 流式分选 | FACSAria II流式分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 基因组DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | TianGen Biotech | -- |
| PCR扩增 | Q5高保真聚合酶 | NEB | -- |
| PCR纯化 | DNA清洁与浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 高通量测序 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| 流式分析 | LSRFortessa SORP流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞增殖检测 | IncuCyte ZOOM活细胞成像系统 | Essen BioSciences | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- |
| RT-qPCR | SYBR TB Green预混液 | Takara | -- |
| ABI qPCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 克隆 | AvrII限制性内切酶 | NEB | R0174S |
| Gibson组装试剂盒 | NEB | E2611S | |
| 基因分型 | 蛋白酶K | -- | -- |
| 斑马鱼实验 | 反义寡核苷酸 | GenePharma | -- |
| 体外转录 | SP6 RNA聚合酶 | Promega | -- |
| T7 RNA聚合酶 | Promega | -- | |
| 整体原位杂交 | BM purple底物 | Roche | 11093274910 |
| 异种移植 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| RNA pull-down | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | -- |
| 质谱 | 快速银染试剂盒 | Beyotime | -- |
| LTQ-Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | Jess全自动蛋白质印迹系统 | Bio-Techne | -- |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 抗TARDBP抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 抗NONO抗体 | Proteintech | 11058-1-AP | |
| 抗CAPRIN1抗体 | Proteintech | 15112-1-AP | |
| 抗IGF2BP1抗体 | Proteintech | 22803-1-AP | |
| 抗hnRNPA1抗体 | Proteintech | 11176-1-AP | |
| 二抗 | Abcam | ab6721 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR-Cas12a敲除筛选 | 细胞系（HeLa、Huh7、MCF7）的Cas12a稳定表达；MOI≈0.3；筛选时间点（0、15、30、45天）；配对crRNA设计参数（PAM序列TTTV、GC含量、独特映射、非靶标错配≥2、排除UUUU）；文库大小和覆盖度（2百万细胞，约175倍覆盖）。 阅读提示：Methods：CRISPR–Cas12a screening；Paired crRNA design and filtering |
| 细胞增殖验证 | GFP阳性细胞百分比监测时间（第0、5、10、15天）；初始细胞数（0.2×10^4）；IncuCyte监测条件；shRNA序列和敲低效率验证。 阅读提示：Methods：Cell proliferation assay；shRNA knockdown assay |
| 敲除-救援实验 | Dox诱导浓度（500 ng/ml）；rtTA转染时间（感染后24小时）；FACS分选后细胞铺板数量；救援载体构建细节（TRE启动子、反向插入）；内源和外源表达的RT-qPCR验证。 阅读提示：Methods：Single-step CRISPR–Cas12a KO-rescue assay；Extended Data Fig. 7 |
| 斑马鱼胚胎实验 | ASO注射剂量（80 pg/胚胎）；RNA注射剂量（40 pg/胚胎）；ASO序列；胚胎数目（每组具体数目见补充表9）；发育阶段观察时间（3-10 hpf）；形态学参数（胚盘高度、宽度、外包程度）。 阅读提示：Methods：Zebrafish husbandry and microinjection；Morphological feature assessment |
| RNA pull-down和MS | 生物素化RNA量（100 pmol）；细胞或胚胎裂解物量（20百万细胞或2500胚胎）；孵育时间和温度；磁珠类型和洗涤条件；MS分析参数（MiST score>0.7）。 阅读提示：Methods：RNA pull-down assay；MS；MS data analysis |