共培养模型建立与多组学分析
系统分析脂肪细胞和卵巢癌细胞之间的代谢相互作用
将原代人网膜脂肪细胞与SKOV3ip1细胞共培养18小时，分离各组分进行代谢组学、转录组学分析，识别差异代谢物和基因
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脂肪细胞通过将葡萄糖转向甘油-3-磷酸来重编程癌细胞代谢，从而促进转移
Adipocytes reprogram cancer cell metabolism by diverting glucose towards glycerol-3-phosphate thereby promoting metastasis
实验完整度
高实验包含体外共培养、多平台代谢组学、同位素示踪、蛋白组学、细胞功能实验、异种移植小鼠模型及人转移瘤样本的成像质谱验证，具有独立多层级验证。
主要模型
SKOV3ip1卵巢癌细胞 HeyA8-luciferase卵巢癌细胞 OVCAR5卵巢癌细胞 人原代大网膜脂肪细胞 人卵巢癌大网膜转移瘤组织 卵巢癌异种移植裸鼠模型
重点核对
共培养比例：1:5 PCV（脂肪细胞:培养基） 共培养时间：18小时（代谢组学）、16小时（蛋白组学）、12小时（qPCR） HIF1α敲低和GPAT3敲低的稳定细胞系构建 Adi CM处理时间：18小时（代谢组学）、6小时（HIF1α稳定性） 小鼠注射细胞数：SKOV3ip1 5百万，HeyA8-luciferase 1百万 同位素示踪葡萄糖浓度：10 mM [U-13C]葡萄糖 体内示踪注射方案：3次80μl 1.34 mM [13C]葡萄糖，间隔15分钟
摘要
在肿瘤微环境中，脂肪细胞充当癌细胞的替代燃料来源。然而，脂肪细胞是否影响癌细胞中的大分子生物合成尚不清楚。在这里，我们利用多平台代谢组学、成像质谱、同位素示踪和基因表达分析，系统表征了原代人脂肪细胞与卵巢癌（OvCa）细胞之间的双向相互作用。我们报道，在与脂肪细胞共培养的OvCa细胞和转移性肿瘤中，糖酵解产生的部分葡萄糖被用于合成甘油-3-磷酸（G3P）。常氧下的HIF1α蛋白调节癌细胞中葡萄糖衍生碳的流向改变，导致甘油磷脂和三酰甘油合成增加。敲低HIF1α或G3P酰基转移酶3（甘油磷脂合成的调节酶）可减少OvCa异种移植模型中的转移。总之，我们表明，在富含脂肪的肿瘤微环境中，癌细胞生成G3P作为关键膜和信号组分的前体，从而促进转移。靶向富含脂肪的肿瘤微环境特有的生物合成过程可能是对抗转移的有效策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂肪细胞是否以及如何通过改变癌细胞中葡萄糖的利用来影响大分子生物合成，从而促进癌症转移？
- 核心机制
- 脂肪细胞通过分泌IL-6激活JAK/STAT信号通路，在常氧条件下稳定癌细胞中的HIF1α蛋白，HIF1α上调HK2和GPD1，将糖酵解产生的葡萄糖碳流更多地转向G3P合成，进而促进甘油磷脂（GPL）和甘油三酯（TG）的合成，支持转移性生长。
- 主要证据
- 体外共培养、代谢组学、[13C]-葡萄糖示踪、蛋白组学、基因表达分析显示HIF1α通过上调HK2和GPD1将葡萄糖碳流转向G3P；敲低HIF1α或GPAT3在异种移植模型中减少大网膜转移，并伴随脂质过氧化增加和铁死亡敏感性增强。
- 研究意义
- 研究表明，在富含脂肪的肿瘤微环境中，癌细胞通过G3P合成关键膜和信号分子，靶向这种脂肪微环境特有的生物合成过程可能是对抗转移的有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
[13C]-葡萄糖稳定同位素示踪肿瘤组织代谢
在人类大网膜转移瘤组织中追踪葡萄糖碳的流向
将人卵巢癌大网膜组织切片与[U-13C]-葡萄糖共孵育，分析糖酵解、TCA循环和G3P的13C标记
验证GPAT3在GPL合成中的作用
确定GPAT3是否是脂肪细胞诱导的GPL合成的关键酶
在共培养体系中敲低GPAT3，进行脂质组学分析，并在异种移植模型中评估肿瘤负担
解析HIF1α介导的代谢重编程
阐明脂肪细胞如何稳定HIF1α并调节葡萄糖利用
在共培养条件下检测HIF1α蛋白表达，使用ODD-luciferase报告基因验证稳定性，蛋白组学鉴定HIF1α下游靶点，并验证IL-6/JAK-STAT信号通路
体内异种移植模型验证HIF1α和GPAT3的作用
验证HIF1α和GPAT3在卵巢癌转移中的作用
将稳定敲低HIF1α或GPAT3的卵巢癌细胞注射入裸鼠腹腔，评估肿瘤负担，并进行同位素示踪分析葡萄糖流向
组织空间脂质分析
在人卵巢癌大网膜转移瘤中验证脂肪细胞邻近癌细胞中GPL的变化
使用MALDI成像质谱分析肿瘤切片，比较邻近脂肪细胞（<200 μm）和远处癌细胞（>200 μm）的脂质组成
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 共培养和细胞培养 | DMEM/F12培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 脂肪细胞分离 | I型胶原酶 | 文中未明确说明 | -- |
| III型胶原酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 透明质酸酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 同位素示踪 | [U-13C]-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | -- |
| 代谢组学 | Acquity UPLC HSS T3 色谱柱 | Waters | -- |
| 1290超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 6550 iFunnel四极杆飞行时间质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 气相色谱-质谱联用（Agilent 6890） | Agilent Technologies | -- | |
| Western blot | HIF1α抗体 | BD Biosciences | 610958 |
| HK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2867 | |
| 磷酸化STAT3 (Tyr708)抗体 | Cell Signaling Technology | 9131 | |
| 总STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| β-actin抗体 | Millipore Sigma | A5441 | |
| 免疫组织化学 | GPAT3抗体 | Novus | NBP-1-93629 |
| Ki-67抗体 | Thermo Scientific Labvision | RM-9160 | |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 4-HNE抗体 | Abcam | ab46545 | |
| 细胞因子处理 | 重组人IL-6 | PeproTech | 200-06 |
| 重组人MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| 重组人IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| 中和抗体 | 抗人IL-6中和抗体 | R&D Systems | MAB206 |
| 抗人IL-8中和抗体 | R&D Systems | MAB208 | |
| 抗人MCP-1中和抗体 | R&D Systems | AB279 | |
| 信号通路抑制 | AZD-1480（JAK抑制剂） | MedChemExpress | HY-10193 |
| STAT3抑制剂（STATTIC） | MedChemExpress | HY-13818 | |
| MEK抑制剂（PD98059） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 铁死亡相关处理 | RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234 |
| zVAD-FMK | Selleckchem | S7023 | |
| 脂质过氧化检测 | 丙二醛检测试剂盒（TBARS） | Cayman | -- |
| 脂质活性氧检测 | C11-BODIPY 581/591荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | MTT（噻唑蓝） | 文中未明确说明 | -- |
| 生物能量代谢分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- |
| 活体成像 | IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 细胞标记 | CellTracker Red CMTPX染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞染色 | 钙黄绿素AM | 文中未明确说明 | -- |
| 质谱成像 | 去甲哈尔满 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 共培养实验 | 脂肪细胞与癌细胞共培养比例（1:5 PCV），共培养时间（18小时），癌细胞种类（SKOV3ip1、HeyA8、OVCAR5等），脂肪细胞分离方法（胶原酶I消化） 阅读提示：Methods: ‘Isolation of primary adipocytes and cell culture’ |
| 代谢组学分析 | 样本量（7例患者脂肪细胞），共培养时间（18小时），代谢产物提取方法（80%冷甲醇），色谱柱（Acquity UPLC HSS T3），质谱仪（Agilent 6550） 阅读提示：Methods: ‘Metabolomic analysis’ |
| [13C]-葡萄糖示踪 | 葡萄糖浓度（10 mM），孵育时间（24小时），组织切片厚度（0.5-1 mm），衍生化方法（MTBSTFA） 阅读提示：Methods: ‘[13C]-glucose tracing analysis’ |
| 基因敲低实验 | shRNA靶序列（HIF1α: TRCN0000003810; GPAT3: TRCN0000162335），转染试剂（Lipofectamine 2000），包装质粒（pCMV-dR8.2 dVPR, pCMV-VSV-G） 阅读提示：Methods: ‘Lentivirus production and RNA interference’ |
| 动物实验 | 小鼠品系（雌性无胸腺裸鼠），细胞注射数量（SKOV3ip1 5百万，HeyA8-luciferase 1百万），观察时间（4周或2周），肿瘤负荷评估方法（IVIS成像、肿瘤重量） 阅读提示：Methods: ‘Mouse studies’ |
| 质谱成像分析 | 组织切片厚度（12 μm），基质（norharmane 7 mg/ml），激光波长（349 nm），像素大小（35×35 μm），距离阈值（200 μm） 阅读提示：Methods: ‘MALDI IMS’ |