建立结直肠癌小鼠模型
建立具有不同免疫表型（免疫排斥型CT26和免疫炎症型MC38）的皮下瘤模型及CT26肝转移模型，用于评估LMWH联合免疫疗法的抗肿瘤效果。
将MC38（5×10^5）和CT26（1×10^6）细胞皮下接种于C57BL/6J和Balb/c小鼠右 flank；将6×10^5 CT26细胞通过肠系膜上静脉注射建立肝转移模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
低分子肝素通过增加淋巴细胞浸润协同增强过继性及抗PD-1为基础免疫疗法在结直肠癌中的疗效
Low molecular weight heparin synergistically enhances the efficacy of adoptive and anti-PD-1-based immunotherapy by increasing lymphocyte infiltration in colorectal cancer
实验完整度
高小鼠皮下及肝转移模型评估疗效，多重免疫组化、MACS分选过继转移、IVIM活体成像、流式细胞术、体外细胞毒性实验及mIHC等多层级验证功能与机制。
主要模型
CT26皮下结肠癌小鼠模型 MC38皮下结肠癌小鼠模型 CT26肝转移小鼠模型
重点核对
LMWH剂量：10 μg/g体重 ACT细胞类型与数量：活化淋巴细胞2×10^7或纯化CD8+ T细胞2×10^6 治疗时间点：皮下模型第8、11、14、17天；肝转移模型第11、14、17、20天 抗PD-1抗体剂量：150 μg/只，同时间点给药 肿瘤细胞接种量：MC38 5×10^5，CT26 1×10^6（皮下）；CT26 6×10^5（肝转移）
摘要
背景：包括过继性细胞治疗(ACT)和免疫检查点抑制剂(ICIs)在内的免疫疗法对大多数结直肠癌(CRC)患者的疗效有限，而对于肝转移患者的疗效更为有限。缺乏抗肿瘤淋巴细胞浸润可能是主要原因，因此迫切需要更有效和更安全的CRC治疗策略。方法：本研究充分评估了低分子肝素(LMWH)联合免疫疗法在微卫星稳定(MSS)高侵袭性小鼠CRC模型中的抗肿瘤协同作用。结果：LMWH与ACT双重联合确实介导了肿瘤生长的停滞和肝转移的抑制，而单独使用LMWH或ACT均无抗肿瘤活性。多重免疫组织化学、纯化CD8+T细胞过继转移实验和IVIM活体成像显示，LMWH与ACT联合明显增加了肿瘤内CD8+T细胞的浸润。机制上，对肿瘤微环境变化的评估显示，LMWH改善了肿瘤血管正常化，促进了活化CD8+T细胞向肿瘤内的运输。同样，在小鼠CT26肿瘤模型中，LMWH联合抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)治疗与单独PD-1阻断相比，提供了更优的抗肿瘤活性。结论：LMWH可通过增加肿瘤内淋巴细胞（尤其是细胞毒性CD8+T细胞）的浸润来增强ACT和基于ICIs的免疫治疗。这些结果表明，LMWH与免疫治疗策略的联合为CRC治疗（尤其是MSS肿瘤）提供了一种有前景且安全的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 低分子肝素(LMWH)是否能通过增加肿瘤内淋巴细胞浸润来增强基于过继性细胞治疗(ACT)和抗PD-1的免疫疗法在结直肠癌，尤其是微卫星稳定(MSS)肿瘤中的疗效？
- 核心机制
- LMWH通过抑制VEGF-A和bFGF等促血管生成因子，促进肿瘤血管正常化，降低FasL表达，减轻肿瘤缺氧，从而改善CD8+ T细胞的运输和浸润，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，增强ACT和抗PD-1疗法的抗肿瘤效应。
- 主要证据
- 在CT26（免疫排斥型）和MC38（免疫炎症型）皮下瘤及CT26肝转移模型中，LMWH联合ACT或抗PD-1疗法显著抑制肿瘤生长和肝转移；多重免疫组化、纯化CD8+ T细胞过继转移实验及IVIM活体成像证实LMWH增加肿瘤内CD8+ T细胞浸润。
- 研究意义
- 该研究支持LMWH联合免疫治疗作为结直肠癌，特别是MSS型“冷”肿瘤的一种有前景且安全的治疗策略，为进一步转化研究和临床试验提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内治疗评估
评估LMWH单药及与ACT或抗PD-1联合治疗对肿瘤生长和肝转移的影响。
皮下模型于第4、7、10、13、16天腹腔注射LMWH（10 μg/g），ACT（2×10^7活化淋巴细胞或2×10^6 CD8+ T细胞）于第8、11、14、17天经尾静脉注射；抗PD-1抗体（150 μg/只）于LMWH给药后24小时内注射。肝转移模型于第4天起LMWH每3天一次，ACT于第11、14、17、20天进行。测量肿瘤体积和重量，评估肝转移情况。
评估肿瘤内淋巴细胞浸润
验证LMWH是否增加肿瘤内CD8+ T细胞浸润，并与治疗疗效相关联。
采用多重免疫组织化学(mIHC)检测MC38和CT26肿瘤中CD8+和CD8+PD-1+ T细胞浸润；通过MACS分选纯化CD8+ T细胞进行过继转移实验；利用IVIM活体成像实时观察CFSE标记的CD8+ T细胞在肿瘤内的迁移和浸润。
探究肿瘤血管正常化机制
验证LMWH是否通过诱导肿瘤血管正常化来促进CD8+ T细胞浸润。
通过免疫荧光和免疫组化检测肿瘤内VEGF-A表达、CD31+血管面积、α-SMA+CD31+周细胞覆盖率、FasL表达以及CD8+ T细胞与血管的空间关系；使用pimonidazole染色评估肿瘤缺氧情况；检测CXCL10表达和CD8+CXCR3+ T细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 淋巴细胞活化 | 刀豆蛋白A | Sigma | C2010 |
| 鼠源白细胞介素-2 | PeproTech | 212-12-5 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Beyotime | C7302 |
| CD8+ T细胞分选 | 小鼠CD8α (Ly-2)磁珠 | Miltenyi | 130-117-044 |
| MiniMACS分离器 | Miltenyi | 130-042-102 | |
| MS分离柱 | Miltenyi | 130-402-201 | |
| MACS多支架 | Miltenyi | 130-402-303 | |
| 药物处理 | 低分子肝素 | National Institutes for Food and Drug Control | 9041-08-1 |
| 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BP0273 | |
| 大鼠IgG2a同型对照 | Bio X Cell | BP0089 | |
| 缺氧检测 | 哌莫硝唑 | Hypoxyprobe | HP6-100kit |
| FITC标记的抗哌莫硝唑抗体 | Hypoxyprobe | -- | |
| 凋亡检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- |
| 多重免疫组化 | PANO多重免疫组化试剂盒 | Panovue | 10144100100 |
| HRP标记的二抗 | Panovue | 10013001040 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 抗淬灭封片剂 | Panovue | 10022001010 | |
| 抗HIF-1α抗体 | SANTA CRUZ | sc-13515 | |
| 抗CD8α抗体 | CST | 98941 | |
| 抗PD-1抗体 | CST | 84651 | |
| 抗CD31抗体 | CST | 77699 | |
| 抗α-SMA抗体 | ProteinTech | 14395-1-AP | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 抗GZMB抗体 | CST | 44153 | |
| 抗CXCR3抗体 | Abcam | ab288437 | |
| 抗CXCL10抗体 | ProteinTech | 10937-1-AP | |
| 图像采集与分析 | Vectra Polaris自动病理成像系统 | Akoya Biosciences | V.1.0 |
| Aperio CS2数字病理扫描仪 | Leica | -- | |
| HALO软件 | Indica Labs | V.3.3.25 | |
| 细胞毒性实验 | CCK8试剂盒 | Dojindo | CK04 |
| 酶标仪 | BioTek | 800TS | |
| 流式细胞术 | 抗CD45 BV510抗体 | BioLegend | 103137 |
| 抗CD3 APC抗体 | BioLegend | 100236 | |
| 抗NK1.1 PE-Cy7抗体 | BioLegend | 108922 | |
| 抗CD4 PerCP-Cy5.5抗体 | BioLegend | 100434 | |
| 抗CD8 FITC抗体 | BioLegend | 126606 | |
| 抗CD69 BV421抗体 | BD | 562920 | |
| 抗PD-1 PE抗体 | BioLegend | 135206 | |
| 抗CD16/32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| 多色流式细胞仪 | BD | LSRFortessa | |
| FlowJo软件 | -- | V.10.5.3 | |
| 活体双光子显微镜 | 活体双光子显微镜平台 | IVIM Technology | IVM-MS |
| 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 | -- | -- | |
| 伊文思蓝 | Absin | abs47002009 | |
| 动物麻醉 | 三溴乙醇 | Nanjing Aibei Biotechnology | M2920 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养 | MC38和CT26细胞系的来源、培养条件（RPMI-1640、10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、37°C、5% CO2）及支原体阴性验证 阅读提示：Methods - Cell lines and mice |
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6J和Balb/c）、周龄（6-8周）、肿瘤细胞接种数量（MC38 5×10^5，CT26 1×10^6）、接种体积（150 μL PBS含50% Matrigel）、肝转移模型细胞数量（6×10^5 CT26）及注射方式（肠系膜上静脉） 阅读提示：Methods - Tumor models and in vivo treatment |
| LMWH给药方案 | LMWH剂量（10 μg/g体重）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（皮下模型第4、7、10、13、16天；肝转移模型从第4天起每3天一次） 阅读提示：Methods - Tumor models and in vivo treatment |
| ACT治疗方案 | 淋巴细胞数量（2×10^7活化淋巴细胞或2×10^6 CD8+ T细胞）、转移途径（尾静脉）、治疗时间（皮下模型第8、11、14、17天；肝转移模型第11、14、17、20天） 阅读提示：Methods - In vitro lymphocyte activation and adoptive cell transfer |
| 抗PD-1治疗 | 抗体克隆（29F.1A2）及同型对照（2A3）、剂量（150 μg/只）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（同ACT时间点） 阅读提示：Methods - Tumor models and in vivo treatment |
| 疗效评估 | 肿瘤体积测量公式（L×W^2/2）、测量频率（每3天）、取材时间（皮下第19天，肝转移第22天）、肝转移评估指标（肝重、肝重/体重比、转移面积/肝总面积比） 阅读提示：Methods - Tumor models and in vivo treatment, Figure legends |