感染后mtDNA水平变化检测
确定弓形虫感染是否改变宿主mtDNA拷贝数。
以Type I弓形虫感染ES-2、HeLa和HFF细胞，qPCR检测DLOOP、mt-ND1、mt-ND6、mt-CYTB和mt-CO1，并以EdU掺入检测mtDNA合成。
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线粒体通过限制叶酸获取抵御胞内病原体
Mitochondria protect against an intracellular pathogen by restricting access to folate.
实验完整度
高含细胞感染模型、CRISPR敲除、同位素示踪代谢组学、质谱及小鼠体内感染验证
主要模型
ES-2人卵巢癌细胞 HeLa细胞及人包皮成纤维细胞HFF 小鼠胚胎干细胞AN3-12及MEF C57BL/6J小鼠腹腔感染模型
重点核对
弓形虫感染MOI为4（RHΔcpsII:mCherry为6），在12、24 hpi检测mtDNA和mRNA ATF4、MTHFD2、SHMT2、HRI、OMA1、GCN2敲除细胞与WT对照比较 ISRIB 200 nM、MTX 200 nM、叶酸68 μM、甲酸2 mM、CH3-THF 25 μM处理及24 hpi检测 [2,3,3-2H]-丝氨酸标记检测dTMP/dTTP的M+1与M+2同位素体 小鼠腹腔注射50个RHΔku80:mCherry速殖子，ISRIB 2.5 mg/kg隔日给药
摘要
作为细胞代谢物的主要消耗者，线粒体可与入侵微生物竞争其生长所需营养。细胞是否利用线粒体代谢抵御感染尚不清楚。本研究发现转录因子ATF4激活基于必需B族维生素叶酸的线粒体防御。在培养哺乳动物细胞感染胞内病原体刚地弓形虫过程中，ATF4通过驱动线粒体内利用叶酸的一碳代谢过程增加线粒体DNA水平。宿主检测到寄生虫效应子诱导的线粒体应激后触发ATF4，限制弓形虫获取dTMP合成所需叶酸，从而抑制寄生虫生长。因此，ATF4重连线粒体代谢，建立基于叶酸的代谢防御抵御弓形虫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞是否利用线粒体代谢重编程来限制胞内病原体获取一碳代谢相关营养并抵御感染。
- 核心机制
- 弓形虫效应子经OMA1-HRI通路激活ISR，ATF4上调线粒体一碳代谢酶MTHFD2和SHMT2，增强线粒体叶酸依赖的一碳代谢，限制弓形虫获取dTMP合成所需叶酸。
- 主要证据
- ES-2、HeLa、HFF及ATF4、MTHFD2、HRI、OMA1敲除细胞的感染实验、同位素示踪代谢组学、叶酸质谱检测，以及小鼠腹腔感染中ISRIB处理增加寄生虫负荷。
- 研究意义
- 揭示ATF4作为叶酸驱动代谢防御的效应因子，确立线粒体代谢在抵御人类病原体弓形虫中的作用，为探索感染期间叶酸代谢及非经典线粒体防御提供框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATF4激活及依赖性验证
确定感染是否诱导ATF4及其对mtDNA增加的调控作用。
质谱筛选感染后上调转录因子，免疫印迹和免疫荧光验证ATF4诱导与核转位，CRISPR-Cas9构建ATF4 KO细胞比较mtDNA水平。
上游ISR通路鉴定
确定感染激活ATF4所依赖的应激感应通路。
用eIF2αS51A mESCs、ISRIB、mTORC1抑制剂、Δmyr1寄生虫、HRI KO和OMA1 KO细胞检测ATF4诱导。
线粒体一碳代谢靶点验证
确定ATF4通过何种靶基因调控mtDNA。
比较感染与tunicamycin处理的ATF4靶基因表达，检测MTHFD2、SHMT2表达，构建MTHFD2 KO细胞及回补实验检测mtDNA。
寄生虫dTMP合成与叶酸获取分析
验证ATF4是否限制弓形虫dTMP合成及叶酸可用性。
用[2,3,3-2H]-丝氨酸标记检测dTMP/dTTP同位素体，分离寄生虫检测dTMP/dTTP，质谱检测叶酸种类，并用MTX、叶酸、甲酸、CH3-THF和ΔcpsII寄生虫验证。
DHFR-TS限速验证
检验dTMP合成是否为弓形虫生长的限速步骤。
构建DiCre可诱导表达DHFR-TS的弓形虫，在HFF单层中进行蚀斑实验比较DHFR-TS表达与killer red对照。
小鼠体内ISR与寄生虫负荷验证
确定ISR/ATF4在体内是否限制弓形虫增殖。
C57BL/6J小鼠腹腔注射弓形虫，隔日注射ISRIB，检测PEC中ATF4靶基因及寄生虫负荷。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| 活细胞成像 | MitoTracker深红线粒体染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Picogreen核酸染料 | -- | -- | |
| Olympus IXplore SpinSR转盘共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| EdU掺入实验 | Click-iT EdU AlexaFluor 488标记试剂盒 | ThermoFisher | C10637 |
| mtDNA定量PCR | 血液和组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| qPCR | PowerSYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 |
| RT-qPCR | SuperScript VILO预混液 | Thermo Fisher Scientific | 11755050 |
| Western blot | 抗小鼠IgG辣根过氧化物酶抗体 | CST | 7076 |
| 抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体 | CST | 7074 | |
| ATF4抗体 | CST | 11815 | |
| MTHFD2抗体 | CST | 41377 | |
| SHMT2抗体 | CST | 33443 | |
| 磷酸化eIF2α（Ser51）抗体 | CST | 9721 | |
| OMA1抗体 | Santa Cruz | 515788 | |
| 质谱蛋白质组学 | TMT10plex标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90110 |
| QExactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | L-丝氨酸-13C3 | Cambridge isotope laboratories | NLM-201595-68-8 |
| 2,3,3-2H-丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1073-1 | |
| 动物实验 | ISRIB | Sigma | 1597403-47-8 |
| 衣霉素 | Sigma | 11089-65-9 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞感染与mtDNA检测 | 弓形虫虫株（RHΔku80:mCherry、Me49等）、MOI（4或6）、感染时间（12、24 hpi）、qPCR归一化基因（RUNX2或ACTB） 阅读提示：Methods中Parasite culture and strains、Quantitative PCR for mtDNA analysis及Fig. 1图注 |
| ATF4及ISR通路验证 | ATF4、HRI、OMA1、GCN2敲除细胞构建与验证；ISRIB 200 nM、tunicamycin 3 μg/ml处理；eIF2αS51A mESCs 阅读提示：Methods中CRISPR/Cas9-mediated gene editing及Fig. 2图注 |
| 线粒体一碳代谢与叶酸限制 | MTHFD2 KO及回补、MTX 200 nM、叶酸68 μM、甲酸2 mM、CH3-THF 25 μM处理浓度与时间 阅读提示：Fig. 2F-H、Fig. 3G-I图注及Methods中MTHFD2 and ATF4 overexpression |
| 同位素示踪代谢组学 | [2,3,3-2H]-丝氨酸0.2 mM标记时长与培养基、寄生虫分离纯度验证 阅读提示：Methods中Stable Isotope Labelling with 2,3,3-2H-serine及Toxoplasma isolation for metabolite extraction |
| 小鼠体内感染 | C57BL/6J小鼠周龄与性别、感染虫株与剂量（50个RHΔku80:mCherry或200个Me49:mScarlet）、ISRIB 2.5 mg/kg隔日给药、3/5/7 dpi取样、每组n=5 阅读提示：Methods中Infection of mice with Toxoplasma及Fig. 4A图注 |