ICL3移植策略开发与传感器筛选
建立可扩展的神经肽传感器开发方法，筛选响应性传感器候选
将来自GRABNE1m、GRABDA2m、GRAB5-HT1.0、GRABACh3.0和dLight1.3b的ICL3移植到多种神经肽GPCR中，在HEK293T细胞中表达并测量膜转运和配体诱导的荧光变化。
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高选择性和灵敏度的基因编码神经肽传感器工具包
A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors.
实验完整度
高包含HEK293T细胞、原代神经元、胰岛、急性脑片和活体小鼠多层级验证，并进行功能与机制验证
主要模型
HEK293T细胞系 原代大鼠皮层神经元 小鼠胰腺胰岛 小鼠急性脑片和活体小鼠
重点核对
HEK293T细胞中传感器荧光响应及EC50测定 原代神经元中配体诱导的荧光变化及拮抗剂阻断 小鼠胰腺胰岛中葡萄糖刺激的SST释放检测 急性脑片电刺激诱导的CRF释放及拮抗剂阻断 活体小鼠光纤记录和双光子成像监测神经肽动态
摘要
神经肽是内分泌和神经系统中调节许多关键生理过程的关键信号分子。理解神经肽在体内的功能需要能够以高特异性、灵敏度和时空分辨率监测其动态变化。然而，由于缺乏直接、灵敏且非侵入性的工具，这一目标一直受到阻碍。我们开发了一系列GRAB（基于G蛋白偶联受体激活的）传感器，用于检测生长抑素（SST）、促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、胆囊收缩素（CCK）、神经肽Y（NPY）、神经降压素（NTS）和血管活性肠肽（VIP）。这些荧光传感器能够在纳摩尔浓度下检测特定神经肽的结合，为研究神经肽在生理和病理生理条件下的释放、功能和调节建立了一个强大的工具包。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何快速、可扩展地开发高选择性和灵敏度的基因编码神经肽传感器，以监测神经肽在生理和病理条件下的实时动态？
- 核心机制
- 通过将现有GRAB传感器中含有cpGFP的整个ICL3移植到神经肽GPCR中，利用配体诱导的GPCR构象变化（TM6向外移动）引起荧光增加，从而生成神经肽传感器。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞、原代神经元、胰腺胰岛、急性脑片和活体小鼠中验证了SST1.0和CRF1.0等传感器的灵敏度、选择性和功能，成功监测了SST和CRF在体外、离体和体内的动态变化。
- 研究意义
- 该策略和传感器工具包为研究多种神经肽在生理和病理生理状态下的释放、调节和功能提供了灵活的方法，有助于理解神经肽在健康和疾病中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
传感器优化
提高传感器荧光响应和膜表达
对候选传感器进行四步优化：修改ICL3替换位点、连接序列、cpGFP和GPCR关键残基；选择最大ΔF/F0的版本作为第一代传感器。
传感器在HEK293T细胞中的特性表征
验证传感器的灵敏度、选择性和下游信号耦合
测量六种传感器的荧光响应、EC50、拮抗剂阻断、配体选择性、光谱特性、动力学，以及G蛋白和β-arrestin耦合。
传感器在原代神经元中的表征
验证传感器在神经元中的膜定位和功能响应
在原代大鼠皮层神经元中表达传感器，测量配体诱导的荧光变化、EC50和拮抗剂阻断。
SST1.0检测神经元和胰岛中SST释放
验证SST1.0传感器检测内源性SST释放的能力
在原代大鼠皮层神经元和小鼠胰腺胰岛中表达SST1.0，用电刺激、高钾或高葡萄糖刺激，测量荧光响应。
CRF1.0检测急性脑片和活体小鼠中CRF释放
验证CRF1.0传感器在离体和体内检测CRF释放的能力
在小鼠CeA、PVN、运动皮层和前额叶皮层表达CRF1.0，用电刺激、尾提、LiCl注射、足底电击和强制跑步等刺激，通过双光子成像或光纤记录测量荧光响应。
行为学验证
评估传感器表达对动物行为的影响
对表达SST1.0或CRF1.0的小鼠进行代谢、旷场、高架十字迷宫、尾悬、强迫游泳和蔗糖偏好测试，并与对照组比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Biological Industries | 06–1055-57–1ACS |
| 胎牛血清 | CellMax | SA301.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 原代神经元培养 | 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200–056 |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 21103049 | |
| B-27添加剂 | Gibco | A3582801 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 分子克隆 | GoldenStar T6 DNA聚合酶 | Tsingke | TSE102 |
| 荧光成像 | Calbryte590 AM钙指示剂 | ATT Bioquest | -- |
| BIM23056 | Abcam | -- | |
| YM 022 | Tocris | -- | |
| α-螺旋CRF | Tocris | -- | |
| Tango检测 | Bright-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | -- |
| 迷你G蛋白检测 | Nano-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | -- |
| 胰腺胰岛分离 | 胶原酶P | -- | -- |
| 胰腺胰岛培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 10099141C |
| 胰腺胰岛成像 | 生长抑素EIA试剂盒 | Phoenix Pharmaceuticals | EK-060–03 |
| 脑片电生理 | 巴氯芬 | -- | -- |
| Western blot | SSTR2抗体 | Abcam | ab134152 |
| CB1R抗体 | Abcam | ab23703 | |
| GFP抗体 | Abcam | ab6556 | |
| β-actin抗体 | CWBIO | CW0096M | |
| 山羊抗兔IgG-HRP偶联物 | CWBIO | CW0103S | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物 | CWBIO | CW0102S | |
| cECL蛋白质印迹试剂盒 | CWBIO | CW0048M | |
| 免疫组织化学 | CRF抗体 | Peninsula Laboratories International | T-4037 |
| Alexa-555偶联山羊抗兔IgG | AAT Bioquest | 16690 | |
| NeuroTrace 640/660 | Invitrogen | N21483 | |
| DAPI Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100–20 | |
| 光纤记录 | CRF | Sigma | C3042 |
| AHCRF 9–41 | Tocris | 1184 | |
| Hamilton注射器 | Hamilton | 65457–02 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HEK293T细胞传感器筛选 | ICL3来源、配体浓度、荧光响应阈值 阅读提示：Methods: Fluorescence imaging of cultured cells and primary neurons; Fig. 1D |
| 原代神经元传感器表征 | 神经元培养条件、配体浓度、ROI数量 阅读提示：Methods: Cultured rat primary cortical neurons; Fig. 2 |
| 胰腺胰岛SST释放检测 | 胰岛分离方法、腺病毒感染条件、葡萄糖浓度 阅读提示：Methods: Pancreatic islet isolation and imaging of SST1.0 sensor; Fig. 3 |
| 急性脑片CRF释放检测 | 病毒注射位点、电刺激参数、成像深度 阅读提示：Methods: Fluorescence imaging of peptide sensors in acute brain slices; Fig. 5 |
| 活体光纤记录CRF | 病毒注射位点、药物剂量、刺激参数 阅读提示：Methods: Fiber photometry recording of CRF1.0 with in vivo drug application; Fig. 6 |