a. 推荐使用50 µL扩增体系;金牌Mix Ver.2用量至少占总反应体积的80%。 b. 模板推荐量: 试剂盒提取的基因组DNA:50~200 ng; CTAB法提取的基因组DNA:100~500 ng; 质粒和噬菌体:0.05~1 ng; cDNA:推荐将反转录产物原液稀释5~10倍后,取1 µL作为模板。 如果模板浓度较低,模板用量可在1~3 µL范围内调整。 过量的模板会导致非特异性扩增,过少的模板易导致PCR扩增效率低。
2. 推荐PCR反应程序
步骤
温度
时间
循环数
预变性
98℃
2 min
1
变性
98℃
10 s
30~35 cyclesc
退火a
Tm+3~5℃
10~15 s
延伸b
72℃
20 s/kb
终延伸
72℃
1~5 min
1
保存
4~12℃
∞
a. 退火温度:参考引物Tm值,建议退火温度设置为引物中Tm较小值+3~5℃; b. 延伸时间:延伸速度为20 s/kb时可以满足大部分模板扩增需要,若模板复杂,可以将延伸时间增加至30 s/kb; c. 扩增循环数:30个循环可满足大部分扩增需要,循环数过多易导致非特异性扩增增加,但若扩增条带较弱,可将循环数增加至35~40个