全基因组筛选envORF
鉴定人类基因组中可能具有抗病毒潜力的包膜来源开放阅读框。
使用tBLASTn搜索hg19人类基因组，以逆转录病毒包膜氨基酸序列为查询，经过滤筛选出1507个独特envORF。
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人类逆转录病毒起源蛋白的演化及其抗病毒活性
Evolution and antiviral activity of a human protein of retroviral origin.
实验完整度
高多组学表达分析、细胞系感染实验、基因敲低与回补、过表达、免疫荧光、进化分析等多层级验证。
主要模型
293T细胞系 Jar和JEG3胎盘来源细胞系 H1人胚胎干细胞 人植入前胚胎及胎盘组织
重点核对
SUPYN敲低Jar细胞中mRNA减少约80% HIV-RD114和HIV-VSVg报告病毒感染实验 SUPYN或RD114env过表达后HIV-RD114感染降低约80% shRNA抗性SUPYN回补实验 多物种SUPYN同源序列及祖先序列重建与感染实验
摘要
内源性逆转录病毒是哺乳动物基因组中丰富的组成部分，起源于古老的生殖系感染。在几种哺乳动物中，这些元件编码的包膜蛋白能够抵御外源性病毒，但这种活性尚未在人类内源性表达的包膜蛋白中得到证实。我们报告，我们的基因组携带大量包膜来源序列，具有限制逆转录病毒感染潜力。为验证这一点，我们鉴定了一种包膜来源蛋白Suppressyn。我们发现，Suppressyn利用其祖先逆转录病毒启动子，在植入前胚胎和发育中的胎盘中表达。细胞培养实验显示，Suppressyn及其类人猿同源蛋白能够限制现存哺乳动物D型逆转录病毒的感染。我们的数据支持一个可推广的模型：逆转录病毒包膜被招募用于宿主免疫和基因组防御。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类基因组中内源性逆转录病毒包膜来源序列是否能够限制现代逆转录病毒感染，以及Suppressyn是否具有抗病毒活性？
- 核心机制
- Suppressyn可能通过结合ASCT2受体，以受体干扰方式限制RDR逆转录病毒感染；可能机制包括在分泌途径内或分泌后结合ASCT2，并可能导致ASCT2部分降解。
- 主要证据
- 细胞培养实验显示SUPYN敲低增加Jar细胞对HIV-RD114的易感性，过表达SUPYN或RD114env降低HIV-RD114感染约80%但对HIV-VSVg无显著影响；SUPYN及其类人猿同源蛋白和祖先重建序列可限制RDRenv介导的感染。
- 研究意义
- 提出envORF构成潜在抗病毒因子库的模型，并提示Suppressyn在类人猿演化中可能保护早期胚胎和生殖系免受RDR感染，以及抵御SYN1介导感染和胎盘合胞化的不良影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
envORF表达谱分析
确定envORF在人类发育、组织和免疫细胞中的表达模式。
挖掘已发表的单细胞和bulk RNA-seq数据集，分析envORF在胚胎、成人组织、免疫细胞和HIV感染细胞中的表达。
SUPYN表达与调控验证
验证SUPYN在胚胎和胎盘中的表达及其表观遗传调控。
分析bulk和单细胞RNA-seq、ATAC-seq、DNase-seq和ChIP-seq数据，并进行胚胎和胎盘组织的免疫荧光染色。
SUPYN抗病毒功能验证
测试SUPYN表达是否影响RDRenv介导的病毒感染。
在Jar、JEG3、H1和293T细胞中进行敲低、过表达和回补实验，使用HIV-RD114、HIV-VSVg和HIV-SMRVenv报告病毒进行感染实验。
SUPYN演化与功能保守性分析
探究SUPYN的进化起源及抗病毒活性在灵长类中的保守性。
比较基因组学分析、dN/dS选择压力分析，并在293T细胞中测试人、黑猩猩、合趾猿、非洲绿猴等物种及祖先重建SUPYN序列的抗病毒活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | 11995065 |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10438026 | |
| RPMI培养基 | GIBCO | 11875093 | |
| MEM培养基 | GIBCO | 11095080 | |
| GlutaMAX添加剂 | GIBCO | 35050061 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 15140122 | |
| 基质胶 | Corning | 356277 | |
| MTESR+培养基 | Stemcell | 05825 | |
| Accutase细胞消化液 | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| CloneR添加剂 | Stemcell | 05888 | |
| 分子克隆 | Q5 DNA聚合酶 | NEB | M0491L |
| TOPO载体 | ThermoFisher | 450245 | |
| NheI限制酶 | NEB | R3131S | |
| KpnI限制酶 | NEB | R3142S | |
| NotI限制酶 | NEB | R0189S | |
| EcoRI限制酶 | NEB | R3101T | |
| InFusion克隆试剂盒 | Takara Bio | 638920 | |
| Western blot | GLO裂解缓冲液 | Promega | E266A |
| 4×Laemmli缓冲液 | -- | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | BioRad | 1610175 | |
| PVDF膜 | BioRad | 1620177 | |
| ECL化学发光试剂 | BioRad | 1705061 | |
| 抗GAPDH抗体(D4C6R, D16H11) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-actin抗体(D6A8) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗HA抗体(C29F4) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ASCT2抗体(V501) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗SUPYN抗体 | Phoenix Pharma | H-059–052 | |
| 免疫荧光 | 抗OCT4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| Western blot | 抗小鼠HRP偶联二抗(#7076) | Cell Signaling Technology | 7076 |
| 抗兔HRP偶联二抗(#7074) | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| IRDye二抗 | Licor | 925–32211, 925–68072, 925–32210, 925–68073 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor偶联二抗 | Invitrogen | -- |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 病毒感染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | 11668030 |
| 聚brene | Santa Cruz Bio | sc-134220 | |
| shRNA转导 | 嘌呤霉素 | GIBCO | A1113802 |
| RT-qPCR | RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 柱上dsDNA酶消化试剂 | Qiagen | 79254 | |
| Maxima cDNA合成及dsDNA酶试剂盒 | ThermoFisher | K1681 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Roche | 04707516001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SUPYN敲低与回补实验 | shRNA靶向SUPYN的敲低效率（约80%）、回补构建体（SUPYN-rescSP或SUPYN-lucSP）的转染条件及表达水平 阅读提示：Methods 'Vector cloning'和'Placental cell shRNA transduction'，图3D-F及fig. S11A |
| 假型病毒感染实验 | 报告病毒（HIV-RD114env、HIV-VSVg、HIV-SMRVenv）的生产条件、polybrene终浓度4 μg/mL、感染后6-8小时换液、72小时后流式检测GFP+细胞 阅读提示：Methods 'Virus production'和'Infection Assays'，图3A-C |
| 细胞系培养 | 293T、Jar、JEG3和H1-hESC的培养基类型、血清浓度、添加物及培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods 'Cell culture' |
| 免疫荧光染色 | 胚胎和胎盘组织的固定、通透、封闭条件，一抗（抗SUPYN 1:200，抗OCT4 1:200）和二抗稀释比例 阅读提示：Methods 'IF microscopy'，图2G-H |
| 进化分析中的感染实验 | 灵长类SUPYN-HA构建体的转染量、HIV-RD114env感染条件、相对感染率归一化方法（以空载体对照） 阅读提示：Methods 'Infection Assays'和'Envelope evolutionary sequence analyses'，图4B-C |