MOB1/NDR2复合物晶体结构解析
在原子水平上阐明MOB1与NDR2的相互作用模式，并与MOB1/LATS1结构比较以鉴定差异结合的关键残基。
纯化人MOB1A（33–216）和NDR2 NTR（25–88），组装复合物，经凝胶过滤纯化后结晶，收集X射线衍射数据并解析结构至2.1 Å；进行结构比较和序列保守性分析。
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稳定的MOB1与Hippo/MST相互作用对发育和组织生长控制并非必需
Stable MOB1 interaction with Hippo/MST is not essential for development and tissue growth control.
实验完整度
高研究包含晶体结构解析、ITC生化结合、人癌细胞功能实验和果蝇体内遗传验证等多个独立证据层级。
主要模型
人乳腺癌MCF-7细胞稳定表达MOB1变体 人HEK293细胞瞬时共表达MOB1与Hippo核心激酶 果蝇mats突变体及成虫盘克隆 果蝇S2R+细胞
重点核对
MOB1变体D63V丧失与LATS1/2及Wts结合，但保留与NDR1/2、Trc、MST1/2和Hpo结合 MOB1变体K104E/K105E丧失与MST1/2及Hpo结合，但保留与LATS1/2、Wts、NDR1/2和Trc结合 MOB1与LATS1结合依赖于MST1/2对MOB1的磷酸化，MOB1/NDR2结合可被磷酸化增强 果蝇mats突变体拯救实验：MOB1(wt)和MOB1(K104E/K105E)可拯救幼虫致死，MOB1(D63V)和MOB1(D63V/K104E/K105E)不能 软琼脂锚定非依赖生长实验：MOB1(wt)和MOB1(K104E/K105E)抑制生长，MOB1(D63V)和MOB1(D63V/K104E/K105E)不抑制
摘要
Hippo肿瘤抑制通路对发育和组织生长控制至关重要，其核心组件包括Hippo（MST1/2）、Warts（LATS1/2）和Tricornered（NDR1/2）激酶以及重要的信号衔接蛋白MOB1。然而，MOB1与不同Hippo核心激酶之间的哪些调控性相互作用协调发育、组织生长和肿瘤抑制仍不清楚。在此，我们报道了MOB1/NDR2复合物的晶体结构，并确定了介导MOB1与Hippo核心激酶差异结合的关键MOB1残基，从而建立了具有选择性相互作用丧失的MOB1变体。通过在人癌细胞和果蝇中研究这些变体，我们发现MOB1/Warts结合对肿瘤抑制、组织生长控制和发育至关重要，而稳定的MOB1/Hippo结合则可有可无，且单独的MOB1/Trc结合不足。总之，我们从分子、细胞生物学和遗传学角度解密了Hippo核心激酶与关键MOB1信号转导子多种相互作用的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MOB1与Hippo核心激酶（MST1/2、LATS1/2、NDR1/2）的不同调控性相互作用在发育、组织生长控制和肿瘤抑制中各自具有怎样的生物学意义？
- 核心机制
- MOB1通过不同残基与Hippo核心激酶差异结合：Asp63介导与LATS1/2（Wts）的结合，Lys104/Lys105介导与MST1/2（Hpo）的稳定结合；MOB1/Warts结合是发育、组织生长控制和Yki活性调控所必需的，而稳定的MOB1/Hippo结合则非必需。
- 主要证据
- 晶体结构解析揭示了MOB1/NDR2复合物结构及Asp63与LATS1 His646的相互作用；ITC和凝胶过滤证实了MOB1变体的选择性结合丧失；人癌细胞（MCF-7、HCT116）的增殖、集落形成和软琼脂实验以及果蝇mats突变体的拯救实验、眼过度生长和wing imaginal disc中Ex表达分析共同支持上述结论。
- 研究意义
- 研究从分子、细胞和遗传层面阐明了MOB1与Hippo核心激酶不同相互作用的生物学重要性，为理解Hippo通路在健康和疾病不同细胞背景下的调控提供了框架，并建立了用于未来研究MOB1调控相互作用的关键研究工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MOB1与NDR/LATS激酶NTR结构域的差异结合生化分析
定量比较MOB1与NDR1/2、LATS1/2的NTR结构域的结合亲和力，并验证关键残基对差异结合的贡献。
用等温滴定量热法（ITC）测定非磷酸化及MST2磷酸化全长MOB1与NDR1、NDR2、LATS1、LATS2 NTR及其突变体的解离常数（Kd）；用凝胶过滤色谱分析全长MOB1变体与NDR2、LATS1、MST2的复合物形成。
选择性丧失相互作用的MOB1变体鉴定
获得仅丧失与特定Hippo核心激酶结合的MOB1变体，以便在细胞和体内研究中解析各相互作用的功能。
在人HEK293细胞和果蝇S2R+细胞中共表达myc标记的MOB1变体与HA标记的激酶，进行低严谨性条件共免疫沉淀和免疫印迹；并用凝胶过滤和ITC验证全长MOB1变体的结合特性；检测MOB1变体的Thr12/Thr35磷酸化。
MOB1变体对人癌细胞锚定非依赖生长的功能验证
确定MOB1与不同Hippo核心激酶的相互作用对肿瘤抑制相关细胞功能（增殖、集落形成、锚定非依赖生长）的必要性。
构建稳定表达HA-MOB1(wt)、HA-MOB1(D63V)、HA-MOB1(K104E/K105E)、HA-MOB1(D63V/K104E/K105E)或空载体的MCF-7细胞池，进行二维增殖（IncuCyte）、集落形成和软琼脂锚定非依赖生长实验；在HCT116细胞中瞬时表达变体并进行增殖和集落形成实验。
MOB1变体在果蝇体内的发育和组织生长控制功能验证
在复杂多细胞生物体中验证MOB1与Hpo/Wts/Trc的相互作用对发育、组织生长控制和Yki活性调控的体内重要性。
利用PhiC31介导的定点整合生成在ubi-63E启动子下表达myc-MOB1变体的转基因果蝇，在mats突变背景下检测幼虫致死拯救、成虫眼过度生长拯救（eyFLP/FRT系统）以及wing imaginal disc中mats克隆的Ex表达（hsFLP/FRT系统）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | pET28a载体 | Novagen | -- |
| BL21(DE3)感受态细胞 | New England BioLabs | -- | |
| Ni2+-NTA亲和层析 | Qiagen | -- | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 结晶 | 聚乙二醇3350 | -- | -- |
| HEPES | -- | -- | |
| X射线衍射 | ADSC Quantum 315r CCD面探测器 | ADSC | -- |
| ITC | ITC200系统 | MicroCal | -- |
| 免疫印迹 | Immobilon-P膜 | Millipore | -- |
| 抗HA抗体12CA5 | -- | -- | |
| 抗myc抗体9E10 | -- | -- | |
| 抗α-微管蛋白抗体YL1/2 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | GeneTex | GTX100118 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling | C29F4 | |
| 抗HA抗体 | Roche | 3F10 | |
| 抗myc抗体 | Cell Signaling | 71D10 | |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling | 3682 | |
| 抗MST2抗体 | Cell Signaling | 3952 | |
| 抗磷酸化Thr12抗体 | Cell Signaling | 8843 | |
| 抗磷酸化Thr35抗体 | Cell Signaling | 8699 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1616 | |
| 抗GAPDH抗体 | Millipore | Mab374 | |
| 抗麦芽糖结合蛋白抗体 | New England BioLabs | E8032 | |
| 抗GST抗体 | Abcam | ab6613 | |
| HRP标记二抗 | GE Healthcare | NA931 | |
| HRP标记二抗 | GE Healthcare | NA934 | |
| HRP标记二抗 | GE Healthcare | NA935 | |
| HRP标记二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2020 | |
| 免疫荧光 | 兔抗Expanded抗体 | -- | -- |
| 鼠抗β-半乳糖苷酶抗体 | Promega | Z3781 | |
| 罗丹明红X标记抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| FITC标记抗鼠抗体 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 激酶实验 | pMal-c2载体 | New England BioLabs | -- |
| 淀粉糖树脂 | New England BioLabs | E8021 | |
| GST-MST1重组蛋白 | Sigma | M9697 | |
| GST-MST2重组蛋白 | Sigma | S6573 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | D6429 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| Schneider果蝇培养基 | Invitrogen | 217200024 | |
| 热灭活胎牛血清 | Invitrogen | 10082147 | |
| 转染 | Fugene 6转染试剂 | Promega | E2692 |
| nucleofector试剂盒V | Lonza | VCA-1003 | |
| Effectene转染试剂 | Qiagen | 301425 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 软琼脂实验 | 琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 16520050 |
| 噻唑蓝四氮唑蓝 | Sigma | -- | |
| 果蝇遗传学 | pKC26w-pUbiq载体 | -- | -- |
| pENTR-3C质粒 | Invitrogen | -- | |
| pLEX目的载体 | Invitrogen | -- | |
| pCMV-R-neo质粒 | -- | -- | |
| pAW载体 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Vectashield封片剂 | Vector Labs | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| Western blot | Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad | 1610737 |
| PCR基因分型 | 基因组DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69506 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MOB1/NDR2晶体结构解析 | 蛋白构建体边界（MOB1A 33–216，NDR2 25–88）、结晶条件（17% PEG 3350、0.1 M HEPES pH 7.5、150 mM MgCl2、14°C）、衍射数据分辨率2.10 Å 阅读提示：Methods 'Protein purification for structural and biochemical analyses' 和 'Crystallization and data collection' 小节；Table 1 |
| ITC结合亲和力测定 | MOB1浓度约240 μM、NTR蛋白浓度约24 μM、缓冲液组成（25 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、1 mM EDTA）、温度25°C、注射次数20次每次2 μl 阅读提示：Methods 'Isothermal titration calorimetry assays' 小节；Fig. 2c–f；Supplementary Fig. 3 |
| MOB1变体共免疫沉淀 | 细胞系（HEK293、S2R+）、转染试剂、低严谨性缓冲液组成、抗体（anti-HA 12CA5、anti-myc 9E10）、MOB1变体列表 阅读提示：Methods 'Antibodies for immunoblotting and immunoprecipitations' 和 'Cell culture and transient transfections' 小节；Supplementary Figs. 5–9 |
| MCF-7稳定细胞池功能实验 | 慢病毒包装质粒用量（pMD.G 2.4 μg、p8.91 0.8 μg、pLEX 4.8 μg）、选择抗生素浓度（嘌呤霉素2.5 μg/ml，维持0.6 μg/ml）、增殖实验细胞密度（5×10^4/孔）、集落形成细胞数（1,000/孔）、软琼脂细胞数（1×10^4/孔）及琼脂糖浓度（0.6%和1%） 阅读提示：Methods 'Generation of stable cell line pools'、'Proliferation and colony formation assays' 和 'Soft agar assays for anchorage-independent growth' 小节；Fig. 4 |
| 果蝇体内拯救实验 | mats无效等位基因（matsroo/matse235）、转基因整合位点（89E11）、启动子（ubi-63E）、热激条件（37°C 1小时，产卵后3天）、果蝇培养温度25°C 阅读提示：Methods 'Drosophila melanogaster genetics' 小节；Supplementary Fig. 16；Fig. 5和Fig. 6的图注及基因型列表 |