建立AMPK β1/2双敲除iMEFs回补系统
验证β1-Ser108磷酸化对细胞AMPK药物激活的必要性。
在β1/2-dKO iMEFs中回补FLAG标记的β1 WT或S108A突变体，用A-769662处理并检测ACC-Ser79磷酸化。
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自噬起始因子ULK1使AMPK对变构药物敏感
The autophagy initiator ULK1 sensitizes AMPK to allosteric drugs.
实验完整度
高包含体外纯化酶、多种基因敲除/敲入细胞系、定量磷酸化蛋白质组学及功能验证，多层级证据相互印证。
主要模型
β1/2-dKO iMEFs α1/2-dKO iMEFs ulk1/2-dKO iMEFs HEK293T细胞
重点核对
β1/2-dKO iMEFs回补β1 WT或S108A突变体，A-769662处理90分钟 α1/2-dKO iMEFs回补KI-α1，苯乙双胍2 mM处理1小时 HEK293T细胞中KI-AMPK表达及H2O2 1 mM或苯乙双胍2 mM处理 ulk1/2-dKO iMEFs中KI-AMPK的Ser108磷酸化检测 体外ULK1磷酸化S108tide及KI-AMPK的激酶实验
摘要
AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一种代谢应激感应酶，负责维持细胞能量稳态。水杨酸和噻吩并吡啶酮A-769662对AMPK的激活关键依赖于β1调节亚基Ser108的磷酸化。在这里，我们展示了Ser108磷酸化在细胞周期调控和响应能量应激促进促生存通路中的可能作用。我们鉴定出自噬起始因子Unc-51样激酶1（ULK1）是细胞中的β1-Ser108激酶。ULK1介导的细胞β1-Ser108磷酸化依赖于AMPK β亚基的肉豆蔻酰化、与AMP/ATP比值升高相关的代谢应激以及AMPK的内在能量感应能力；这些特征与AMP诱导的肉豆蔻酰开关机制一致。我们进一步证明细胞AMPK信号独立于激活环Thr172磷酸化，为Ser108磷酸化的生理作用提供了潜在见解。这些发现揭示了AMPK可能独立于Thr172磷酸化维持细胞能量稳态的新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ULK1是否磷酸化AMPK β1-Ser108，以及该磷酸化如何影响AMPK对变构药物的敏感性和信号传导。
- 核心机制
- ULK1在AMP/ATP比值升高和AMPK β1肉豆蔻酰化依赖的条件下磷酸化β1-Ser108，从而稳定ADaM位点并使AMPK对A-769662和水杨酸敏感；此外，AMPK信号可在不依赖Thr172磷酸化的情况下发生。
- 主要证据
- 利用β1/2-dKO、α1/2-dKO和ulk1/2-dKO iMEFs回补实验，结合ULK1抑制剂SBI-0206965、体外激酶实验和定量磷酸化蛋白质组学，证明ULK1介导β1-Ser108磷酸化并增强药物激活的AMPK信号。
- 研究意义
- 揭示了ULK1-AMPK β1-Ser108轴作为AMPK变构药物敏感性的调控机制，为增强AMPK靶向药物的效力提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定量磷酸化蛋白质组学分析
探究β1-Ser108磷酸化的细胞功能。
对表达β1-S108A或S108E的β1/2-dKO iMEFs进行稳定同位素二甲基标记的定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，并验证PAK2-Ser141磷酸化。
鉴定β1-Ser108的反式激酶
确定在代谢应激下磷酸化Ser108的上游激酶。
在HEK293T细胞中表达激酶失活（KI）AMPK α1(D141A)β1γ1，用葡萄糖饥饿、H2O2、苯乙双胍等处理，检测Ser108磷酸化；并利用α1/2-dKO iMEFs回补KI-α1验证。
体外筛选和验证ULK1激酶
确认ULK1直接磷酸化β1-Ser108并影响AMPK药物敏感性。
用S108tide肽段筛选284种Ser/Thr激酶，用纯化的ULK1、ULK2或ULK1/FIP200/Atg13复合物磷酸化S108tide或KI-AMPK，检测Ser108磷酸化和AMPK活性。
验证ULK1在细胞中磷酸化β1-Ser108
证明ULK1是细胞中β1-Ser108的激酶。
使用ULK1抑制剂SBI-0206965或ulk1/2-dKO iMEFs，检测H2O2或苯乙双胍诱导的KI-AMPK Ser108磷酸化。
探究AMP-肉豆蔻酰开关机制
研究AMP和β1肉豆蔻酰化对ULK1磷酸化Ser108的要求。
检测AMPK γ1-D245A突变体、β1-G2A突变体对苯乙双胍或葡萄糖饥饿诱导Ser108磷酸化的影响；测量腺苷酸能量电荷；体外检测肉豆蔻酰化对ULK1磷酸化的影响。
验证不依赖Thr172的AMPK信号
确定AMPK信号是否可不依赖Thr172磷酸化。
在α1/2-dKO iMEFs中回补α2 WT或T172A突变体，用苯乙双胍和/或A-769662处理，检测ACC-Ser79、Ser108和ULK1-Ser555磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | pan AMPK α抗体 | Cell Signaling Technology | 2793 |
| FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 | |
| AMPK β1-pSer108抗体 | Cell Signaling Technology | 4181 | |
| ACC-pSer79抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| PAK1/2-pSer144/Ser141抗体 | Cell Signaling Technology | 2606 | |
| ULK1-pSer555抗体 | Cell Signaling Technology | 5869 | |
| ULK1-pSer757抗体 | Cell Signaling Technology | 6888 | |
| AMPK-β1抗体 | Abcam | ab58175 | |
| 药物处理 | A-769662 | Abcam | ab120335 |
| 免疫印迹 | IRDye 680RD或800CW标记的抗免疫球蛋白G抗体 | LI-COR Biosciences | -- |
| IRDye 680RD标记的链霉亲和素 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Life Sciences | -- |
| 高性能链霉亲和素Sepharose | GE Life Sciences | -- | |
| FLAG合成肽 | GL Biochem (Shanghai) | -- | |
| 激酶实验 | ULK2重组蛋白 | Abcam | -- |
| 药物处理 | SBI-0206965 | ApexBio | -- |
| AZD8055 | ApexBio | -- | |
| INK128 | ApexBio | -- | |
| 细胞转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega Corporation | -- |
| 质谱分析 | Q-Exactive plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 核苷酸测量 | ABISCIEX 5500 QTRAP质谱仪 | ABISCIEX | -- |
| 免疫印迹 | Immobilon FL聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| Odyssey膜成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| β1/2-dKO iMEFs回补与A-769662处理 | A-769662浓度20 μM、处理时间90分钟、n=3、检测pACC-Ser79 阅读提示：Methods“Lentiviral-mediated AMPK expression and purification”及图1图注 |
| 定量磷酸化蛋白质组学 | 苯乙双胍2 mM处理1小时、S108A与S108E比较、稳定同位素二甲基标记、TiO2富集 阅读提示：Methods“Quantitative global and phosphoproteomic analysis”及图2图注 |
| KI-AMPK反式磷酸化检测 | KI-α1(D141A)表达、葡萄糖饥饿4小时、H2O2 1 mM 45分钟、苯乙双胍2 mM 1小时等处理条件 阅读提示：Methods“Lentiviral-mediated AMPK expression and purification”及图3图注 |
| 体外ULK1激酶实验 | S108tide浓度100 μM（筛选）或200 μM [γ-32P]ATP（活性实验）、ULK1 30分钟、A-769662 20 μM或水杨酸10 mM 阅读提示：Methods“Kinase activity assays”及图4图注 |
| ULK1细胞水平验证 | SBI-0206965 10 μM、H2O2 1 mM 45分钟、苯乙双胍2 mM 1小时、ulk1/2-dKO iMEFs 阅读提示：Methods“Lentiviral-mediated AMPK expression and purification”及图6图注 |
| AMPK信号不依赖Thr172验证 | α2(T172A)回补、苯乙双胍2 mM和/或A-769662 100 μM处理1小时、检测pACC-Ser79、Ser108、ULK1-Ser555 阅读提示：图8图注及对应Results描述 |