建立患者来源模型库
生成可筛选的PDC和匹配PDX模型，用于后续药物敏感性测试。
从患者手术切除的肿瘤样本中建立PDX和PDC，并进行STR谱、基因表达和靶向测序验证模型代表性。
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表型驱动的精准肿瘤学作为个体患者临床决策的指导
Phenotype-driven precision oncology as a guide for clinical decisions one patient at a time.
实验完整度
高包含患者来源原代培养、PDX模型、体外药物筛选、体内验证、组学分析及两项n=1共临床试验。
主要模型
头颈部鳞状细胞癌患者来源原代培养（PDC） 患者来源异种移植（PDX）模型 NSG小鼠
重点核对
PDC与匹配PDX模型的药物反应一致性验证 HN137-Pri和HN137-Met细胞对gefitinib和YM155的IC50差异验证 PDX体内药效实验的剂量、给药频率和肿瘤体积测量 YAP1过表达和敲低对药物敏感性的功能验证 YAP1在166例OSCC组织芯片中的表达与生存分析
摘要
基因组驱动的癌症治疗在个性化癌症治疗中已获得显著地位。然而，在缺乏生物标志物驱动治疗策略的适应症中，其效用仍然有限。在此，我们提出一种“表型驱动的精准肿瘤学”方法，基于以下理念：在离体患者个体化模型中，对扰动（化学或遗传）的生物学反应可以作为临床治疗反应的预测性生物标志物。我们为头颈部鳞状细胞癌建立了一个可筛选的患者来源原代培养（PDC）库，该库可重复性地预测匹配的患者来源异种移植（PDX）模型中的治疗反应。重要的是，PDC可以指导临床实践，并在两项n=1的共临床试验中预测肿瘤进展。对来自其中一个模型的PDC进行的全面“组学”分析显示，YAP1是约24%的口腔鳞状细胞癌中治疗反应和生存的推定生物标志物。我们设想，所提出的PDC方法的规模化可以揭示用于治疗分层的生物标志物，并在未来指导实时治疗决策。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在缺乏生物标志物驱动治疗策略的适应症中，患者来源离体模型对扰动的表型反应能否作为临床治疗反应的预测性生物标志物？
- 核心机制
- YAP1高表达通过激活促生存通路（如上调BIRC5）促进肿瘤细胞存活，并赋予对EGFR-TKI（gefitinib）的耐药性，同时增加对IAP抑制剂（YM155）的敏感性。
- 主要证据
- PDC高通量药物筛选预测患者特异性 vulnerabilities，并在匹配PDX中验证；HN137-Pri和HN137-Met细胞对gefitinib和YM155的差异敏感性在PDX中重现；YAP1过表达足以赋予gefitinib耐药并增加YM155敏感性；YAP1高表达与OSCC患者不良生存相关。
- 研究意义
- 表型驱动的精准肿瘤学方法可补充基因组学方法，利用患者个体化模型在临床相关时间范围内指导治疗决策，并发现预后生物标志物，尤其适用于缺乏分子分层的适应症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量小分子筛选
鉴定患者特异性和泛癌治疗 vulnerabilities。
对来自7例患者的PDC进行高通量小分子筛选，使用抗癌化合物库和激酶抑制剂库。
PDX体内验证
验证PDC筛选出的药物敏感性在体内是否一致。
在患者匹配的PDX模型中测试候选药物，监测肿瘤体积变化。
共临床试验
评估PDC/PDX指导的治疗决策在临床中的可行性。
基于PDC和PDX结果，两名患者接受gefitinib或erlotinib单药治疗，监测肿瘤反应和生物标志物。
YAP1机制研究
探究YAP1在gefitinib耐药和转移中的作用。
通过YAP1过表达和敲低、Western blot、IHC、arrayCGH、FAIRE-seq和生存分析验证YAP1功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- |
| RNA纯化 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| 逆转录 | Superscript II逆转录酶 | Thermo Fisher | 18064-071 |
| qPCR | SYBR Green | KAPA | KK4602 |
| 药物处理 | 顺铂 | Tocris | 2251 |
| YM155 | Selleckchem | S1130 | |
| 吉非替尼 | Cayman Chemical | 13166 | |
| 药物溶解 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力试剂 | Promega | G7572 |
| 荧光检测 | TECAN Infinite M1000 pro多功能酶标仪 | TECAN | -- |
| PDX建立 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| NSG小鼠 | Jackson Laboratory | 005557 | |
| PDC衍生 | IV型胶原酶 | Thermo Fisher | 17104019 |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Thermo Fisher | 61870036 |
| 胎牛血清 | Biowest | S181B | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 支原体检测 | Venor®GEM OneStep支原体检测试剂盒 | Minerva Biolabs | 11-8100 |
| 体内给药 | Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |
| Flavopiridol | LC Laboratory | A-3499 | |
| Belinostat | MedChem Express | HY-10225 | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | Sigma | 332607 | |
| captisol | CyDex, Inc. | -- | |
| shRNA敲低 | MISSION® shRNA文库 | Sigma-Aldrich | -- |
| 过表达 | CCSB-Broad慢病毒表达文库 | -- | OHS6085, OHS6087, OHS6269, OHS6270 and OHS6271 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | 11668500 |
| 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| 筛选 | 杀稻瘟菌素 | Thermo Scientific | R21001 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂 | Calbiochem | 539134 | |
| phosSTOP磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 04906837001 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR | 927-40000 | |
| YAP1抗体 | Abcam | ab52771 | |
| BIRC5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17779 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| cleaved caspase3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25778 | |
| V5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81594 | |
| 二抗 | LI-COR | -- | |
| IHC | YAP1抗体 | Abcam | ab52771 |
| 高通量筛选 | 抗癌化合物库 | Selleckchem | L3000 |
| 激酶抑制剂库 | Selleckchem | L1200 | |
| 384孔板 | PerkinElmer | 6007558 | |
| Operetta高内涵成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 基因组DNA提取 | QIAamp DNA迷你试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| arrayCGH | Agilent Sure Tag基因组DNA标记试剂盒 | Agilent | 5190-3399 |
| Agilent原位杂交试剂盒 | Agilent | 5188-6420 | |
| 微阵列 | miRNAeasy试剂盒 | QIAGEN | 217004 |
| Quick-Amp单色标记试剂盒 | Agilent | 5190-0442 | |
| Agilent Human GXP_8X60K微阵列 | Agilent | AMADID: 039494 | |
| FAIRE-seq | Illumina HiSeq-Hi-Output测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDC和PDX模型建立 | 肿瘤样本来源、患者数量（24例）、PDX成功率（58.1%）、NSG小鼠周龄（5-7周）、肿瘤片段大小（~1 mm³）、Matrigel浓度（5%或20%） 阅读提示：Methods中“Generation and passaging of PDXs”和“Derivation of PDC cell lines and cell culture”小节，以及Table 1 |
| 高通量小分子筛选 | 细胞接种数量（4000细胞/孔）、化合物库（Selleckchem L3000和L1200）、处理时间（24小时后加药，72小时后固定）、荧光检测参数 阅读提示：Methods中“Chemical compound library screens and analysis”小节，以及Fig. 2b和Supplementary Tables 6和7 |
| PDX体内药效实验 | 药物剂量（gefitinib 25 mg/kg、YM155 2 mg/kg、flavopiridol 5 mg/kg、belinostat 40 mg/kg、docetaxol 8 mg/kg、olaparib 50 mg/kg、erlotinib 150 mg/kg）、给药途径和频率、小鼠性别和数量（n=5或n=6）、肿瘤体积测量频率（每2天） 阅读提示：Methods中“Drug preparation and in vivo treatment”小节，以及Fig. 1e、2e、2f、3e和图注 |
| 共临床试验 | 患者HN137的gefitinib剂量（250 mg/天）和给药方案、患者HN177的erlotinib剂量（文中未明确说明）、临床反应评估方法（CT扫描、CA19-9） 阅读提示：Results中“PDC/PDX-guided treatment of patients in co-clinical trials”小节，以及Fig. 3c、3f和3g |
| YAP1功能验证 | YAP1 shRNA序列、过表达构建体、抗体稀释比例（Western blot 1:2000，IHC 1:200）、TMA样本量（166例）和评分标准 阅读提示：Methods中“Lentiviral and RNAi knockdown of genes”、“Immunoblotting”、“IHC”和“Scoring of YAP1 expression in TMAs”小节，以及Fig. 4c、4d、4f和4g |