验证CaBdf1 BD与乙酰化组蛋白肽的结合
确定CaBdf1 BD1和BD2是否识别多乙酰化组蛋白尾部。
纯化重组CaBdf1 BD1和BD2，使用组蛋白肽微阵列评估结合，并通过下拉实验验证H4ac4肽结合；YF突变体作为对照。
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选择性BET溴结构域抑制作为抗真菌治疗策略
Selective BET bromodomain inhibition as an antifungal therapeutic strategy.
实验完整度
高包含体外重组蛋白结合实验、白色念珠菌遗传突变体生长实验、小鼠感染模型毒力实验及晶体结构解析，具备功能与机制验证。
主要模型
白色念珠菌（Candida albicans）菌株 小鼠血行播散性念珠菌病模型 重组CaBdf1 BD1/BD2蛋白
重点核对
Bdf1 BD失活突变体（Y248F、Y425F或结构域缺失）对白色念珠菌生长的影响 小鼠感染模型中肾脏真菌负荷（CFU/g）的定量 小分子化合物对CaBdf1 BD与人Brd4 BD的IC50及Kd值 晶体结构中化合物与Bdf1 BD结合口袋的相互作用及空间位阻
摘要
侵袭性真菌感染在免疫受损个体中导致显著的发病率和死亡率，迫切需要新的抗真菌治疗策略。本文研究染色质相互作用模块——BET家族蛋白的溴结构域（BD）——作为白色念珠菌（一种主要的人类真菌病原体）的潜在抗真菌靶点。我们发现BET蛋白Bdf1在白色念珠菌中是必需的，使其两个BD失活的突变导致体外活力丧失和小鼠毒力降低。我们报告了高选择性抑制白色念珠菌Bdf1而对人BD选择性高的小分子化合物。Bdf1 BD的晶体结构揭示了这些抑制剂的结合模式，这些模式与人BET结合口袋在空间上不相容。此外，我们报告了一种二苯并硫氮杂䓬酮化合物，其表型模拟Bdf1 BD失活突变对白色念珠菌活力的影响。这些发现确立了BET抑制作为一种有前景的抗真菌治疗策略，并确定Bdf1为一个抗真菌药物靶点，可以选择性抑制而不拮抗人BET功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BET家族溴结构域（BD）是否可作为白色念珠菌的抗真菌靶点，以及能否获得选择性抑制真菌Bdf1而不抑制人BET蛋白的小分子抑制剂。
- 核心机制
- Bdf1通过其BD结合多乙酰化组蛋白H4尾部，其BD功能对白色念珠菌体外活力和体内毒力至关重要；小分子化合物通过与Bdf1 BD结合口袋结合，与人BET BD因空间位阻而不结合，从而实现选择性抑制。
- 主要证据
- 重组CaBdf1 BD的肽微阵列和下拉实验显示其结合多乙酰化H4肽；Bdf1 BD失活突变体在体外生长和小鼠肾脏真菌负荷显著降低；高通量筛选获得化合物1和2，分别选择性抑制CaBdf1 BD1和BD2，ITC和HTRF测定亲和力，晶体结构揭示选择性结构基础；化合物3在BD2失活的菌株中表现出生长抑制。
- 研究意义
- 确立了BET抑制作为有前景的抗真菌治疗策略，并将Bdf1鉴定为一个可选择性抑制而不拮抗人BET功能的抗真菌药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Bdf1 BD功能对白色念珠菌活力的必要性
确定Bdf1及其BD功能是否为白色念珠菌体外生长所必需。
构建BDF1条件表达菌株（pTetO-BDF1）和BD失活突变体（BD1或BD2缺失或YF点突变），在固体和液体培养基中评估生长。
验证Bdf1 BD功能对小鼠毒力的影响
确定Bdf1 BD功能是否影响白色念珠菌在小鼠感染模型中的毒力。
使用Tet-OFF系统条件敲低Bdf1或BD失活突变体感染小鼠，7天后测定肾脏真菌负荷。
评估人BET抑制剂对CaBdf1 BD的抑制活性及结构基础
比较CaBdf1 BD与人Brd4 BD对BET抑制剂的敏感性，并解析CaBdf1 BD晶体结构。
使用HTRF和ITC测定JQ1、PFI-1、IBET-151、bromosporine对BD的抑制活性；解析未结合和结合抑制剂的CaBdf1 BD晶体结构。
筛选选择性抑制CaBdf1 BD的小分子化合物
发现靶向CaBdf1 BD1或BD2而不抑制人BET BD的小分子抑制剂。
对约80,000个化合物进行HTRF高通量筛选，通过剂量-反应曲线验证选择性，并测定化合物1和2的IC50、Kd及晶体结构。
验证Bdf1 BD1抑制剂在细胞内的表型模拟
确定小分子化合物3能否在白色念珠菌细胞内模拟BD1失活的生长抑制效果。
在BD1或BD2失活的菌株中测试化合物3的生长抑制活性，并测定细胞EC50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白-小分子结合
评估真菌生长与毒力
结构解析
评估细胞毒性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | BL21(DE3)感受态细胞 | New England Biolabs | C2527I |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | Qiagen | -- |
| Superdex 75 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白浓缩 | Centricon浓缩装置 | Millipore | -- |
| 下拉实验 | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher | -- |
| 组蛋白肽微阵列 | 组蛋白肽微阵列 | Active Motif | 13005 |
| MODified微阵列标记试剂盒 | Active Motif | 13006 | |
| Western blot | 抗GST抗体 | GE Healthcare | -- |
| 抗GST抗体 | Dutscher | 27-4577-01 | |
| 组蛋白H4抗体 | Active Motif | 39269 | |
| ITC | NanoITC量热仪 | TA Instruments | -- |
| HTRF | 抗GST铽穴状化合物供体 | Cisbio Bioassays | 61GSTTLA |
| 链霉亲和素-d2受体 | Cisbio Bioassays | 610SADLA | |
| EPIgeneous结合域稀释液 | Cisbio Bioassays | 62DLBDDF | |
| 检测缓冲液 | Cisbio Bioassays | 62DB2FDG | |
| 384孔白色板 | Greiner | 781080 | |
| ClarioStar酶标仪 | BMG LABTECH | -- | |
| 高通量筛选 | Echo声波液体分配器 | -- | -- |
| 化合物 | JQ1 | Clinisciences | -- |
| PFI-1 | Sigma | -- | |
| IBET-151 | Sigma | -- | |
| bromosporine | Sigma | -- | |
| 化合物1 | ChemDiv | -- | |
| 细胞培养 | HeLa细胞 | ATCC | CCL-2 |
| IMR90细胞 | ATCC | CCL-186 | |
| 细胞毒性 | 细胞增殖试剂盒I（MTT） | Roche | -- |
| 细胞培养 | 96孔微板 | Falcon | 353072 |
| 菌株构建 | Gibson组装试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent | -- | |
| 生长实验 | Multiskan FC微孔板光度计 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Bdf1 BD与组蛋白肽结合 | 重组CaBdf1 BD1/BD2的浓度（1 μM）、肽微阵列类型、YF突变对照 阅读提示：Methods: Pull-down and peptide array assays; Figure 1d,e |
| 白色念珠菌生长实验 | 起始细胞浓度（5,400 cells/ml）、培养基（SC）、温度（30°C）、多西环素（50 μg/ml）或甲硫氨酸/半胱氨酸（5 mM/0.25 mM）浓度 阅读提示：Methods: Growth assays; Figure 2c–e, Figure 8e,f |
| 小鼠感染实验 | 小鼠品系（BALB/c，雌性，8周龄）、接种量（2×10^5细胞）、感染途径（静脉）、每组n=6、终点（7天）、肾脏CFU测定 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Figure 2f,g |
| HTRF和ITC结合实验 | 蛋白浓度（HTRF 5 nM）、肽浓度、化合物浓度范围、缓冲液组成、孵育时间和温度 阅读提示：Methods: HTRF assay; ITC; Supplementary Table 1 |
| 高通量筛选 | 化合物库来源（ChemDiv, LifeChem）、筛选浓度（20 μM或8 μM）、DMSO终浓度（1%或0.4%） 阅读提示：Methods: High-throughput chemical screening; Figure 6a |
| 晶体结构解析 | 蛋白浓度、沉淀剂组成、冷冻保护剂、衍射数据收集和精修统计 阅读提示：Methods: Crystallization and crystal structure determination; Supplementary Table 2 |