鉴定MYC与Menin调控基因的重叠
探究MYC与Menin调控基因表达是否存在相关性
对过表达或敲低MYC、Menin的HT1080细胞进行RNA-seq，比较差异基因并作GO富集；用qRT-PCR和Western blot验证10个共调控靶基因。
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Menin增强c-Myc介导的转录以促进癌症进展
Menin enhances c-Myc-mediated transcription to promote cancer progression.
实验完整度
高含RNA-seq、ChIP-seq、Co-IP/GST pull-down、EMSA、细胞功能实验、裸鼠移植瘤及19对临床HCC样本
主要模型
人纤维肉瘤HT1080细胞 tet诱导型P493-6 B细胞 人肝癌HepG2细胞 裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
shMYC/shMEN1/shASH2L/shRBBP5/shCDK9/shCycT1等敲低的分组与靶序列 FP处理浓度1 μM用于抑制CDK9活性 RNA-seq与ChIP-seq数据集GSE86504及fold change>1.5阈值 裸鼠每组n=5皮下接种HT1080稳转细胞 19对HCC及癌旁正常肝组织样本
摘要
Menin是一种功能难以捉摸的蛋白，在不同背景下表现出独特的抑制或促进肿瘤发生的能力。Menin促进癌基因功能的作用在很大程度上归因于其在形成介导H3K4me3的MLL甲基转移酶复合体中的关键作用。在此，我们发现Menin以一种不依赖H3K4me3活性的方式增强癌基因MYC反式激活活性的意外作用。有趣的是，我们发现Menin直接与MYC的TAD结构域相互作用，并与MYC共定位于E-Box，以P-TEFb依赖的方式增强MYC靶基因的转录。我们进一步证明，Menin通过转录促进癌细胞中MYC靶基因的表达，在体外和体内均刺激细胞增殖和细胞代谢。我们的结果揭示了一种先前未被认识到的机制，即Menin作为癌基因调控因子发挥作用，对MYC介导的基因转录至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Menin是否以及如何参与MYC失调背景下的肿瘤发生，其调控MYC转录活性是否依赖MLL/H3K4me3。
- 核心机制
- Menin直接结合MYC的TAD结构域和CycT1，招募P-TEFb促进RNA Pol II Ser2磷酸化，以不依赖H3K4me3的方式增强MYC靶基因转录。
- 主要证据
- RNA-seq显示MYC与Menin调控基因高度重叠；Co-IP/GST pull-down/EMSA证明Menin经MYC结合E-box；ChIP-seq与ChIP证实二者共定位；敲低ASH2L/RBBP5不影响靶基因；FP或shCDK9/shCycT1消除Menin效应；体外增殖代谢实验与裸鼠移植瘤及HCC样本支持。
- 研究意义
- 揭示Menin作为MYC介导转录的关键癌基因调控因子的新机制，提示联合靶向MYC与Menin信号可能对二者异常表达的恶性肿瘤有治疗意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证H3K4me3非依赖性
判断Menin增强MYC靶基因转录是否依赖MLL HMT复合体完整性
敲低ASH2L或RBBP5后检测H3K4me3及MYC靶基因mRNA和蛋白水平。
证明Menin经MYC结合E-box
明确Menin与MYC的相互作用及其与E-box结合方式
Co-IP、GST pull-down、结构域截短体pull-down、EMSA及supershift检测Menin与MYC/MAX及E-box的结合。
检测染色质共定位
验证MYC与Menin在染色质上是否共占E-box
ChIP-seq比较MYC与Menin结合位点及motif；ChIP-qPCR检测SCD1、NPM1、BCAT1的E-box占用，并在shMYC或shMEN1下检测。
解析Menin-P-TEFb-MYC链路
确定Menin是否通过P-TEFb促进MYC转录延伸
Co-IP与GST pull-down检测Menin与CycT1/CDK9及结构域结合；检测RNA Pol II Ser2/Ser5磷酸化、TR及CDK9募集，使用FP或shCDK9/shCycT1干扰。
评估细胞代谢与增殖功能
验证Menin是否经MYC促进癌细胞增殖与代谢
检测增殖曲线、ECAR、葡萄糖摄取、乳酸生成、TG含量与Nile red染色，并在shMYC背景下检测。
体内与临床样本验证
验证Menin对肿瘤生长的影响及与临床HCC的相关性
裸鼠皮下接种HT1080稳转细胞观察肿瘤生长；检测19对HCC与癌旁组织的MEN1 mRNA和Menin蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| MYC表达抑制 | 四环素 | Sigma | -- |
| 质粒转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | -- |
| 稳转细胞筛选 | G418 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| shRNA敲低 | 靶向人MYC、MEN1、ASH2L、RBBP5、CDK9、Cyclin T1和SCD1的慢病毒shRNA | Sigma | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life technologies | -- |
| DNase | Ambion | -- | |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RT-qPCR | iQ SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- |
| iCycler实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 蛋白定量 | Bradford检测试剂盒 | Sangon Bio | -- |
| Western blot | Menin抗体 | Bethyl Laboratories | A300-105A |
| c-Myc（9E10）抗体 | Zymed | MA1-980 | |
| SCD抗体 | Abcam | ab19862 | |
| H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| BCAT1抗体 | Abcam | ab195663 | |
| H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402s | |
| CyclinT1抗体 | Proteintech | 20992-1-AP | |
| CDK9抗体 | Proteintech | 11705-1-AP | |
| ASH2L抗体 | Proteintech | 12331-1-AP | |
| TBP抗体 | Proteintech | 22006-1-AP | |
| RBBP5抗体 | Proteintech | 13181-1-AP | |
| PPAT抗体 | Proteintech | 15401-1-AP | |
| NPM1抗体 | Proteintech | 60096-1-Ig | |
| LDHA抗体 | Proteintech | 21799-1-AP | |
| GST抗体 | Proteintech | 10000-0-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 18142-1-AP | |
| CTD丝氨酸2磷酸化抗体 | Covance | MMS-129R | |
| CTD丝氨酸5磷酸化抗体 | Covance | MMS-134R | |
| MAX抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-764 | |
| laminB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6216 | |
| Flag-M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| HA抗体 | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| HRP标记抗兔和抗鼠二抗 | Bio-Rad | -- | |
| Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白纯化 | pET-22b(+)载体 | Novagen | -- |
| pGEX-4T-1载体 | GE | -- | |
| 克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| RNA完整性检测 | Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- |
| RNA-seq建库 | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- |
| RNA-seq测序 | Illumina Hiseq4000平台 | Novogene | -- |
| ChIP | EZ-ChIP试剂盒 | Millipuro | -- |
| Bioruptor超声破碎系统UCD-300 | -- | UCD-300 | |
| MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 9402S | |
| CDK9抗体 | Santa Cruz | sc-8338x | |
| CTD丝氨酸2磷酸化抗体 | Covance | MMS-1129R | |
| Menin抗体 | Bethyl Lab | A300-105A | |
| ChIP-seq | H3K4me3抗体 | Millipore | 07-473 |
| RNA Pol II（N-20）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-899 | |
| ChIP-seq测序 | Illumina Hiseq2500平台 | BGI | -- |
| EMSA | 尼龙膜 | Millipuro | -- |
| Pierce化学发光核酸检测模块 | Thermo | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XF96e分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| Seahorse XF糖酵解压力测试报告生成器 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 葡萄糖摄取检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 脂质染色 | 尼罗红 | Sigma | -- |
| TG检测 | 生化甘油三酯测定试剂盒 | NJJC Bio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA-seq差异基因分析 | fold change>1.5阈值及HT1080细胞MYC/Menin干预方式 阅读提示：Results第一部分及Fig. 1a–c图注；Methods RNA-seq analysis |
| shRNA敲低实验 | shMYC、shMEN1、shASH2L、shRBBP5、shCDK9、shCycT1、shSCD1靶序列 阅读提示：Methods Plasmids and established stable cells及Supplementary Table 1 |
| CDK9抑制处理 | flavopiridol 1 μM处理条件 阅读提示：Fig. 5d,g,i图注及Methods Cell culture and reagents |
| EMSA结合实验 | E-box序列GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC及竞争DNA倍比 阅读提示：Fig. 2g,h图注及Methods Electrophoretic mobility shift assay |
| 裸鼠移植瘤实验 | 5周龄雄性BALb/c裸鼠、每组n=5、皮下接种及7天后测量频率 阅读提示：Fig. 6o图注及Methods Animal studies |
| 临床HCC样本检测 | 19对HCC与癌旁组织来源及qRT-PCR/Western blot方法 阅读提示：Fig. 6p,q图注及Methods Clinical human HCC specimens |
| Seahorse糖酵解检测 | 葡萄糖、oligomycin、2-DG浓度（图注为10 mM/1.0 mM/50 mM，Methods为10 μM/1 μM/50 mM，存在差异） 阅读提示：Fig. 6c,g图注与Methods Extracellular acidification rate对照核对 |