建立动静脉代谢组学方法
量化BAT和腿部肌肉对循环代谢物的净摄取和释放。
在雄性小鼠中，从左心室（动脉血）、Sulzer静脉（BAT引流）和股静脉（腿部引流）采集血液，并通过LC-MS测量代谢物丰度。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
《产热过程中棕色脂肪和骨骼肌代谢通量的定量分析》
Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis
实验完整度
高包含动静脉代谢组学、同位素示踪、功能敲低实验、组织学及蛋白检测等多个独立证据层级，并包含机制验证。
主要模型
C57BL/6J雄性小鼠 棕色脂肪组织（BAT） 骨骼肌（腿部肌肉） 成熟棕色脂肪细胞
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J雄性 饲养温度：热中性（30°C）、慢性冷适应（6°C）、急性冷暴露（6°C，4小时）和CL316,243处理（1mg/kg，4小时） 动静脉血采集部位：左心室（动脉）、Sulzer静脉（BAT）、股静脉（腿部） 同位素示踪：静脉注射[U-13C,15N]-谷氨酰胺（0.175 g/kg）和15N-NH4Cl（0.04 g/kg），在2.5、5、15分钟采样 功能验证：siRNA敲低Glul后测量NE刺激的耗氧率（OCR）和氨水平
摘要
棕色脂肪组织（BAT）的适应性产热以热量形式消耗卡路里，使其成为有吸引力的抗肥胖靶点。然而，BAT如何参与循环代谢物交换仍不清楚。在这里，我们通过动静脉代谢组学，在进食的雄性小鼠冷暴露期间量化了BAT和骨骼肌中的代谢物交换。这鉴定了器官之间意外消耗、释放和共享的代谢物。组织通量的定量分析表明，葡萄糖和乳酸提供约85%的适应性产热碳源，并且冷暴露和CL-316,243触发显著不同的燃料利用谱。在冷适应中，BAT还通过净消耗氨基酸（谷氨酰胺除外）大幅增加氮摄取。同位素示踪和功能研究表明，谷氨酰胺分解与谷氨酰胺合成酶催化的合成同时进行，这避免了氨积累并促进燃料氧化。这些数据强调了BAT作为葡萄糖和氨基酸汇的能力，并为指导转化研究提供了BAT燃料利用的定量和全面图景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BAT和骨骼肌在产热过程中如何与循环代谢物交换，以及不同产热状态下燃料利用的定量特征是什么？
- 核心机制
- 在冷适应中，BAT同时进行谷氨酰胺分解和合成（通过谷氨酰胺合成酶），这种底物循环有助于清除氨，从而促进燃料氧化。
- 主要证据
- 动静脉代谢组学显示葡萄糖和乳酸提供约85%的碳源；同位素示踪显示冷适应BAT中谷氨酰胺碳进入TCA循环增加；siRNA敲低Glul降低NE刺激的耗氧率并升高氨水平。
- 研究意义
- 该研究提供了BAT燃料利用的定量全景，强调了BAT作为葡萄糖和氨基酸汇的能力，指导针对肥胖和癌症的转化研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测不同热适应条件下的BAT和腿部代谢物交换
比较热中性、慢性冷适应、急性冷暴露和CL316,243处理对BAT和腿部代谢物摄取和释放的影响。
将小鼠分为四组：热中性（30℃）、慢性冷适应（逐步降至6℃）、急性冷暴露（6℃，4小时）、CL316,243注射（1mg/kg，4小时）。进行AV采样和代谢组学分析。
量化BAT碳通量
定量计算BAT对循环碳源（如葡萄糖、乳酸、氨基酸）的摄取通量。
使用AV浓度梯度和超声测量的血流量计算BAT总碳流入。
量化BAT氮通量
评估BAT在不同热条件下对氨基酸和含氮代谢物的净摄取和释放。
计算总氮流入和流出，分析氨基酸、核苷酸等含氮代谢物的AV差异。
同位素示踪追踪谷氨酰胺碳和氮命运
追踪谷氨酰胺在BAT中的分解和合成路径。
静脉注射[U-13C,15N]-谷氨酰胺或15N-NH4Cl，在不同时间点收集BAT、肝脏和血清，分析标记代谢物的形成。
验证谷氨酰胺合成酶的功能
通过siRNA敲低Glul，研究GS在棕色脂肪细胞产热中的作用。
在成熟棕色脂肪细胞中转染siRNA靶向Glul或非靶向对照，测量NE刺激的耗氧率、氨水平和同位素标记的谷氨酰胺生成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AV血样采集 | Q Exactive质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Vanquish超高效液相色谱系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| XBridge BEH Amide色谱柱 | Waters Corporation | -- | |
| 脂质皂化 | Atlantis T3色谱柱 | Waters | -- |
| GC-MS分析 | 8890气相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 5977B单四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 组织处理 | 冷冻研磨机 | Retsch | -- |
| 组织学 | Zeiss Axio-Scan.Z1扫描仪 | Zeiss | -- |
| Zeiss Zen Blue软件 | Zeiss | -- | |
| 超声成像 | Vevo 3100成像系统 | Visualsonics | -- |
| MX550S换能器 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| siRNA转染 | 靶向Glul的siGenome siRNA池 | Horizon Discovery | M-062120-01-0005 |
| 非靶向siRNA对照 | Horizon Discovery | D-001206-14-05 | |
| Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Thermofisher | 13778150 | |
| Western blot | 谷氨酰胺合成酶抗体 | BD | 610517 |
| 解偶联蛋白1抗体 | CST | 14670 | |
| 解偶联蛋白1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| 纽蛋白抗体 | SantaCruz | sc-73614 | |
| 谷氨酰胺酶抗体 | ProteinTech | 12855 | |
| 谷氨酸脱氢酶1抗体 | ProteinTech | 14299 | |
| 脂肪酸合酶抗体 | CST | 3180 | |
| 过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗体 | CST | 2443 | |
| 基因表达分析 | Qiazol裂解试剂 | QIAGEN | -- |
| RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| 高效率cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Green PCR预混液 | CWBio | CW0955 | |
| 海马分析 | 海马XFe96分析仪 | Agilent | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| Hoechst 33342染色剂 | -- | -- | |
| 氨测量 | 硝普钠 | -- | -- |
| GC-MS分析 | MTBSTFA + 1% TBDMCS衍生化试剂 | MilliporeSigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物饲养与分组 | 小鼠品系：C57BL/6J雄性；饲养温度：热中性（30°C）、慢性冷适应（逐步降至6°C）、急性冷暴露（6°C，4小时）、CL316,243处理（1mg/kg）；饮食：标准饲料自由采食；小鼠周龄：8周开始适应，12周实验。 阅读提示：Methods - Mice |
| AV血液采集 | 采血时间：麻醉后5分钟内；动脉血来自左心室，BAT静脉血来自Sulzer静脉，腿部静脉血来自股静脉；采血管无抗凝剂；血清制备条件：冰上20分钟，10000 x g离心10分钟。 阅读提示：Methods - AV blood sampling and tissue processing |
| 代谢物测量 | LC-MS方法：Q Exactive质谱仪，Vanquish UHPLC，XBridge BEH Amide色谱柱；梯度条件；代谢物定量采用内源标准品。 阅读提示：Methods - Soluble metabolite extraction and measurements using LC-MS |
| 血流量测量 | 超声仪器：Vevo 3100；探头频率：50 MHz；测量Sulzer静脉血流；心率需在400-500 bpm之间。 阅读提示：Methods - Echocardiography and Vascular Imaging |
| 同位素示踪 | 示踪剂剂量：[U-13C,15N]-谷氨酰胺（0.175 g/kg），15N-NH4Cl（0.04 g/kg）；给药方式：眼眶后注射；采样时间：2.5、5、15分钟。 阅读提示：Methods - In vivo isotope tracing |
| 细胞培养与siRNA敲低 | 棕色脂肪细胞分离自新生小鼠，永生化处理；分化条件：高糖DMEM，10% FBS，20 nM胰岛素，1 nM T3等；siRNA转染：25 nM，Lipofectamine RNAiMax，转染后4天进行实验。 阅读提示：Methods - Cell culture, siRNA Transfection |
| 海马分析 | 注射试剂浓度：NE 1μM，Oligomycin 2.5μM，FCCP 0.5μM，Rotenone/Antimycin A 0.5μM；测量循环数：3个循环，3分钟测量，NE后10个循环。 阅读提示：Methods - Seahorse Analysis |