筛选与肝TIC自我更新相关的lncRNA
从HCC相关lncRNA中鉴定调控肝TIC自我更新的候选分子
分析在线数据集筛选高表达且与HCC严重程度和预后相关的lncRNA，构建lncRNA沉默细胞并进行sphere形成实验
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LncSox4通过Stat3介导的Sox4表达促进肝肿瘤起始细胞的自我更新
LncSox4 promotes the self-renewal of liver tumour-initiating cells through Stat3-mediated Sox4 expression.
实验完整度
高包含体外sphere形成、体内移植瘤模型和患者样本分析，并有ChIP、ChIRP、RIP等机制验证
主要模型
原代HCC细胞 CD133+肝TICs BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
CD133+分选肝TICs与原代HCC细胞，sphere形成实验（5,000细胞，2周） BALB/c裸鼠皮下注射梯度细胞（10、1×10^2至1×10^5），3个月观察肿瘤形成 Stat3 ChIP和Sox4启动子荧光素酶报告基因实验 LncSox4与Stat3的RNA pull-down、RIP和RNA EMSA验证 LncSox4与Sox4启动子结合的ChIRP实验及启动子缺失突变
摘要
肝癌在患者中倾向于无症状发展，因此大多数患者确诊时已处于晚期。越来越多的证据表明，肝肿瘤起始细胞（TICs）负责肝癌的发生和复发。然而，肝TIC自我更新的分子机制尚不清楚。在此我们发现，一种名为LncSox4的长链非编码RNA（lncRNA）在肝细胞癌（HCC）组织和肝TICs中高表达。我们发现LncSox4是肝TIC自我更新和肿瘤起始所必需的。LncSox4与Stat3相互作用并将其招募到Sox4启动子，启动Sox4的表达，Sox4在肝TICs中高表达并且是肝TIC自我更新所必需的。Sox4的表达水平与HCC发展、临床严重程度和患者预后相关。总之，我们发现LncSox4在肝TICs中高表达并且是其自我更新所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝肿瘤起始细胞自我更新的分子机制是什么？
- 核心机制
- LncSox4与Sox4启动子结合并招募Stat3，启动Sox4表达，进而促进肝TIC自我更新。
- 主要证据
- 在原代HCC细胞和CD133+肝TICs中，LncSox4敲低抑制sphere形成和肿瘤起始，Sox4回补可挽救；ChIP和ChIRP证实LncSox4介导Stat3结合Sox4启动子；Sox4表达与HCC临床严重程度和预后相关。
- 研究意义
- LncSox4–Stat3–Sox4通路为根除肝TICs提供了新靶点，Sox4可作为HCC预后标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LncSox4在HCC和肝TICs中的表达
确认LncSox4在肝癌及肝TICs中的表达特征和临床相关性
在原发HCC样本、CD133+分选TICs和onco spheres中检测LncSox4表达，并进行临床相关性分析
验证LncSox4对肝TIC自我更新和肿瘤起始的功能
确定LncSox4在肝TIC自我更新、肿瘤起始和体内生长中的作用
敲低或过表达LncSox4，进行sphere形成、连续传代sphere形成和裸鼠皮下移植瘤实验
鉴定LncSox4下游靶基因Sox4
探索LncSox4调控肝TIC自我更新的分子靶点
在LncSox4沉默细胞中检测NFκB、Wnt/β-catenin、Notch和Hedgehog通路靶基因表达，验证Sox4表达变化
验证LncSox4通过Sox4调控肝TIC功能
确定Sox4在LncSox4介导的肝TIC自我更新中的必要性
在LncSox4沉默细胞中回补Sox4，或在Sox4敲除细胞中过表达LncSox4，进行sphere形成和肿瘤起始实验
验证LncSox4与Sox4启动子的直接结合
确定LncSox4是否通过结合Sox4启动子调控其表达
ChIRP实验检测LncSox4与Sox4启动子富集，CRISPR/Cas9删除LncSox4结合区域，检测Sox4表达和sphere形成
鉴定LncSox4与Stat3的相互作用
寻找LncSox4的结合蛋白并验证互作
RNA pull-down联合质谱鉴定Stat3，RIP、双FISH、RNA EMSA和邻近发光均相实验验证互作及结合区域
验证LncSox4依赖Stat3调控Sox4启动子
确定LncSox4在Stat3结合Sox4启动子和激活转录中的作用
Stat3 ChIP、Sox4启动子荧光素酶报告基因、H3K4me3和H3K27ac ChIP，在LncSox4沉默细胞中过表达Stat3
验证Stat3和Sox4对肝TIC自我更新的必要性
确定Stat3–Sox4通路在肝TIC自我更新和肿瘤起始中的作用
CRISPR/Cas9敲除Stat3或Sox4，sphere形成、连续传代和裸鼠移植瘤实验，并在CD133+ TICs中敲低Stat3或Sox4
分析Sox4表达的临床相关性
评估Sox4表达与HCC严重程度和预后的关系
分析在线队列和原发HCC样本中Sox4表达，进行Kaplan–Meier生存分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| Western blot | 抗β-Actin抗体 | Sigma-Aldrich | A1978 |
| 抗Sox4抗体 | Proteintech Group | 17919-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗Oct4抗体 | Cell Signaling Technology | 2750 |
| Western blot/ChIP | 抗Stat3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 |
| ChIP | H3K4Me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 |
| H3K27Ac抗体 | Cell Signaling Technology | 4353 | |
| 流式分选 | 藻红蛋白偶联CD133抗体 | Miltenyi Biotec | 130-098-826 |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | 28718-90-3 |
| 病毒浓缩 | PEG5000 | Sigma-Aldrich | 175233-46-2 |
| sphere形成 | 表皮生长因子 | Life Technologies | E5036-200UG |
| N2添加剂 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Life Technologies | 17504-044 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Millipore | GF446-50UG | |
| RNA EMSA | LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒 | Thermo Scientific | 20158 |
| Northern blot/RNA EMSA | 化学发光核酸检测模块 | Thermo Scientific | 89880 |
| 体外转录 | T7 RNA聚合酶 | Roche | 10881767001 |
| RNA标记 | 生物素RNA标记混合物 | Roche | 11685597910 |
| sphere形成 | 超低吸附六孔板 | Corning | 3471 |
| 荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 慢病毒包装 | LentiCRISPRv2载体 | -- | 52961 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肝TIC分选与sphere形成 | CD133+分选阈值和抗体克隆号；sphere形成接种5,000细胞、2周、直径>100μm计数；培养基添加20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、N2和B27 阅读提示：Methods 'Flow cytometry'和'Sphere formation'小节，Figure 1j、2a图注 |
| LncSox4敲低/过表达 | pSiCoR shRNA序列（Supplementary Table 4）；慢病毒感染和嘌呤霉素筛选条件；过表达载体PBPLV 阅读提示：Methods 'Knockdown and knockout'小节，Supplementary Table 4，Figure 2a图注 |
| 裸鼠移植瘤实验 | BALB/c裸鼠6周龄雄性；皮下注射细胞数梯度（10、1×10^2、1×10^3、1×10^4、1×10^5）；肿瘤起始观察3个月；肿瘤生长实验每样本5只、起始实验6只；肿瘤体积测量时间点 阅读提示：Methods 'Mouse models'小节，Figure 2c,d图注，Figure 2e,f图注 |
| ChIP和ChIRP | 抗体用量（Stat3、H3K4Me3、H3K27Ac）；交联条件（1%甲醛10 min）；超声破碎条件；ChIRP生物素探针；qPCR引物 阅读提示：Methods 'ChIP and ChIRP'小节，Figure 3f、5a,c,e图注 |
| RNA pull-down和RIP | 生物素标记RNA体外转录；细胞裂解液交联条件；抗体用量；protein A/G beads；qPCR检测LncSox4富集 阅读提示：Methods 'RNA pull-down and mass spectrometry'和'RIP assay'小节，Figure 4a-c图注 |