DSS诱导结肠炎的剂量优化与模型建立
确定可在恒河猴中诱导轻至中度胃肠道损伤而无明显临床症状的DSS剂量和疗程
对健康SIV阴性恒河猴经饮水给予DSS，先后测试1%×5天、0.25%×7天和0.25%×10天，通过结肠镜和组织学评估结肠炎严重程度
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未感染SIV的恒河猴实验性结肠炎重现致病性SIV感染的重要特征
Experimental colitis in SIV-uninfected rhesus macaques recapitulates important features of pathogenic SIV infection.
实验完整度
高包含DSS诱导的恒河猴急慢性结肠炎模型、SIV感染恒河猴对照、SIV感染的非洲绿猴、16S rDNA焦磷酸测序、MRI及组织学和流式细胞术功能验证
主要模型
未感染SIV的恒河猴（急性/慢性DSS结肠炎模型） 慢性SIV感染的恒河猴 慢性SIV感染的非洲绿猴
重点核对
DSS剂量0.25%（w/v），饮水给药10天；1%用于剂量优化5天 DSS分子量35,000至50,000 Da，购自MP Biomedicals（货号180558） 动物分组：未处理对照恒河猴、急性DSS处理恒河猴（n=6）、慢性DSS处理恒河猴（n=2） 停药后3天安乐死并采集血浆、PBMC及结肠各段、肝脏、远端淋巴组织 组织学分级采用Geboes改良0–3级评分，由不知分组的病理学家评定 MRI使用3T Philips Achieva，静脉注射gadofosveset trisodium 0.12 mL/kg（250 mM，含0.03 mM钆）
摘要
胃肠道黏膜损伤及由此导致的微生物移位，据推测在HIV感染所特有的慢性炎症加剧和持续免疫激活中起重要促进作用。本研究采用我们利用葡聚糖硫酸钠（DSS）建立的未感染SIV的恒河猴化学诱导结肠炎非人灵长类模型，直接检验该假说。DSS处理导致胃肠道屏障损伤，并伴有相关的微生物移位、炎症和免疫激活。通过磁共振成像方法纵向监测结肠炎的进展和严重程度。对SIV感染的非洲绿猴（SIV的天然宿主物种，感染期间不表现为胃肠道损伤或慢性免疫激活）进行DSS处理，导致结肠炎，并伴有血浆SIV RNA、sCD14、LPS、CRP水平升高和黏膜CD4+ T细胞丢失。这些结果共同支持以下假说：导致局部和全身微生物移位及伴随免疫激活的胃肠道损伤，是AIDS发病机制的重要决定因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在缺乏慢病毒感染的情况下，胃肠道损伤导致的微生物移位是否足以独立引起局部和全身炎症及免疫激活，从而驱动HIV/SIV致病特征？
- 核心机制
- DSS诱导的胃肠道上皮屏障损伤导致细菌产物从肠腔移位至结肠固有层、肝脏和肠系膜淋巴结，并进入体循环，进而驱动局部及全身炎症和T细胞免疫激活。
- 主要证据
- DSS处理的未感染SIV恒河猴出现结肠组织病理损伤、claudin-3缺失、MPO+中性粒细胞浸润、E. coli产物在结肠和腋窝淋巴结的移位、Mx1/P-STAT1/P-STAT3/Ki67升高及血浆IL-8和外周血CD4+Ki67+、CD8+Ki67+ T细胞增加；SIV感染的非洲绿猴经DSS处理后血浆LPS、sCD14、CRP、病毒载量升高及黏膜CD4+ T细胞减少。
- 研究意义
- 支持胃肠道损伤导致局部和全身微生物移位及相关免疫激活是AIDS发病机制重要决定因素的假说，并建立了可用于非侵入性MRI监测结肠炎及评估干预策略的非人灵长类急慢性结肠炎模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
急性DSS结肠炎的胃肠道损伤评估
验证DSS处理是否在未感染SIV的恒河猴中重现SIV感染的胃肠道病理特征
停药3天后安乐死，采集结肠各段组织，进行H&E病理分级、claudin-3免疫组化及MPO+中性粒细胞定量图像分析
局部微生物移位与局部免疫激活检测
检验胃肠道损伤是否导致结肠固有层微生物移位及局部炎症和T细胞激活
对结肠组织进行E. coli、Mx1、P-STAT1、P-STAT3、Ki67免疫组化及定量图像分析，并用流式细胞术检测结肠CD4+Ki67+和CD8+Ki67+ T细胞比例
全身微生物移位与全身免疫激活检测
确定胃肠道损伤是否足以引起远端淋巴结和体循环的微生物移位及全身炎症和免疫激活
对腋窝淋巴结进行E. coli、Mx1、P-STAT1免疫组化定量，对肝脏和肠系膜淋巴结进行16S rDNA 454焦磷酸测序，检测血浆IL-8及外周血CD4+Ki67+、CD8+Ki67+ T细胞
慢性DSS结肠炎与MRI纵向监测
建立多次DSS循环诱导的慢性结肠炎，并评估钆基血池对比剂MRI无创监测结肠炎的可行性
对2只健康SIV阴性恒河猴进行3至4个DSS循环，每循环0.25% DSS 14天加停药14天，每循环后行MRI和结肠镜，最后安乐死行组织学评估
SIV感染非洲绿猴的DSS处理实验
在SIV天然宿主中检验叠加的胃肠道损伤是否驱动全身炎症、免疫激活、病毒复制和黏膜CD4+ T细胞丢失
对2只慢性SIV感染的非洲绿猴间隔约200天给予两次DSS处理，纵向检测血浆LPS、sCD14、CRP、病毒载量及黏膜CD4+ T细胞
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DSS给药 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 180558 |
| MRI | 钆磷维塞三钠 | Lantheus Medical Imaging | -- |
| Philips Achieva 3T磁共振仪 | Philips | -- | |
| 免疫组化 | 小鼠抗CD68抗体（克隆KP1） | Dako | -- |
| 小鼠抗CD163抗体（克隆10D6） | Novocastra/Leica | -- | |
| 兔单克隆抗CD4抗体（克隆EPR6855） | Epitomics, Inc. | -- | |
| 磷酸化STAT1兔单克隆抗体（Tyr701；克隆58D6） | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 磷酸化STAT3兔单克隆抗体（Tyr705；克隆D3A7） | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 小鼠Polink-1 AP检测系统 | Golden Bridge International, Inc. | -- | |
| 兔Polink-1 HRP检测系统 | Golden Bridge International, Inc. | -- | |
| 兔Polink-2染色系统 | Golden Bridge International, Inc. | -- | |
| Impact DAB显色剂 | Vector Laboratories | -- | |
| Warp Red显色剂 | Biocare Medical, Inc. | -- | |
| 1X Diva缓冲液 | Biocare Medical | -- | |
| 流式分析 | CD4 Pacific Blue抗体（克隆OKT4） | BioLegend | -- |
| CCR5 PE抗体（克隆3A9） | BD Biosciences | -- | |
| CD28 ECD抗体（克隆CD28.2） | Beckman Coulter | -- | |
| CD95 PE-Cy5抗体（克隆DX2） | BD Biosciences | -- | |
| CD8 PE-Cy7抗体（克隆SK1） | BD Biosciences | -- | |
| CD38 APC抗体（克隆OK10） | NIH Nonhuman Primate Reagent Resource | -- | |
| CD3 APC-Cy7抗体（克隆SP34-2） | BD Biosciences | -- | |
| Ki67 FITC抗体（克隆B56） | BD Biosciences | -- | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque Plus分离液 | GE Healthcare | -- |
| 核酸提取 | QIAmp DNA粪便试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Trizol试剂 | Life Technologies | -- | |
| 16S rDNA测序 | Accuprime高保真Taq聚合酶 | Invitrogen | -- |
| Agencourt Ampure XP试剂盒 | Beckman Coulter Genomics | -- | |
| QuantIT dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Qiagen minElute柱 | Qiagen | -- | |
| 454 FLX测序仪 | Life Sciences | -- | |
| 病毒载量检测 | SuperScript III第一链合成预混液（qRT-PCR） | Invitrogen | -- |
| TaqMan PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| MicroAmp光学96孔板 | Applied Biosystems | -- | |
| CRP检测 | 猴CRP ELISA试剂盒 | Life Diagnostics | -- |
| LPS检测 | 鲎变形细胞裂解物检测 | Cambrex | -- |
| sCD14检测 | Quantikine人sCD14免疫检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| Luminex分析 | Milliplex MAP非人灵长类细胞因子磁珠多重检测试剂盒 | Darmstadt, Germany | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DSS给药与剂量优化 | DSS浓度（1%和0.25% w/v）、给药天数（5、7、10天）、总饮水量100 mL/kg、DSS分子量35,000至50,000 Da、饮用水中加入非着色Kool Aid 阅读提示：Methods“Dextran sulfate sodium dosing and duration”小节 |
| 急性与慢性结肠炎模型分组 | 急性模型0.25% DSS 10天，停药后3天采样；慢性模型每循环14天DSS加14天停药，共3至4循环；各组动物数量（急性n=6、慢性n=2、对照n=4） 阅读提示：Methods“Animals and ethics statement”及“Dextran sulfate sodium dosing and duration”小节 |
| 组织病理学评分 | Geboes改良0–3级评分标准、病理学家盲法评估、结肠各段取材范围 阅读提示：Methods“Histopathology scoring”小节及Supplementary Table 1 |
| 免疫组化与定量图像分析 | 抗体克隆号与稀释比例（CD68 1:400、CD163 1:400、CD4 1:200、P-STAT1 1:200、P-STAT3 1:200）、抗原修复条件、ROI大小500×500 μm 阅读提示：Methods“Immunohistochemistry and quantitative image analysis”小节 |
| MRI纵向监测 | 3T Philips Achieva设备、gadofosveset trisodium剂量0.12 mL/kg（250 mM）、结肠充气量、MRI炎症评分0–3级标准 阅读提示：Methods“Longitudinal evaluation and quantification of colitis by MRI”小节及Supplementary Table 2和3 |
| SIV感染非洲绿猴DSS实验 | 两次DSS处理间隔约200天、血浆LPS稀释5倍并85°C加热15分钟、sCD14检测范围、病毒载量检测限100 copies/ml 阅读提示：Methods“Assessment of the levels of microbial translocation in AGMs”和“Plasma viral load quantification”小节 |
| 16S rDNA焦磷酸测序 | V1–V3区引物序列、OTU相似度97% cutoff、测序平台454 FLX及Titanium化学 阅读提示：Methods“Isolation of nucleic acids and 454 Pyrosequencing”小节 |