PAR-CLIP鉴定RC3H1全转录组结合位点
在高分辨率下鉴定人类RC3H1的mRNA靶标和结合位点。
在稳定诱导表达FLAG/HA-RC3H1的HEK293细胞中，用4SU或6SG标记新生RNA，紫外交联后免疫沉淀RC3H1-RNA复合物，经RNase处理、放射性标记、SDS-PAGE分离并构建cDNA文库进行Illumina测序；通过诊断性T到C或G到A转换确定交联位点并构建结合簇。
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RC3H1转录后调控A20 mRNA并调节IKK/NF-κB通路活性
RC3H1 post-transcriptionally regulates A20 mRNA and modulates the activity of the IKK/NF-κB pathway.
实验完整度
高包含PAR-CLIP组学、SILAC蛋白互作、mRNA半衰期、pSILAC、EMSA、报告基因、Western blot及数学模型等多层级功能与机制验证
主要模型
HEK293细胞（Flp-In 293 T-REx） 稳定诱导表达FLAG/HA-RC3H1的HEK293细胞 重组RC3H1-N1和RC3H1-N2蛋白
重点核对
PAR-CLIP使用4SU或6SG标记，4SU实验2个生物学重复（4SU-1、4SU-2），6SG实验1个重复 RC3H1敲低使用siRNA 1和siRNA 2（50 nM，Lipofectamine RNAiMAX），并同时敲低RC3H2 mRNA衰变检测使用放线菌素D（5 μg/ml或50 μg/ml）阻断转录，于0、2、4 h或0、1、2 h取样 DNA损伤诱导使用neocarzinostatin（200 ng/ml处理4 h或250 ng/ml），TNFα处理使用10 ng/ml处理4 h A20 3′UTR结合位点验证使用37-nt ARE-stem-loop序列克隆至d2GFP报告基因，以及反义LNA（100 nM）转染
摘要
RNA结合蛋白RC3H1（又称ROQUIN）通过3′UTR组成型衰变元件（CDE）促进TNFα mRNA降解。本文应用PAR-CLIP技术对人类RC3H1进行鉴定，发现约3,800个mRNA靶标，包含超过16,000个结合位点。大量位点与共有CDE不同，并揭示了一种嵌入发夹结构中的U富集序列的结构-序列基序。RC3H1优先结合短寿命和DNA损伤诱导的mRNA，表明该RNA结合蛋白在DNA损伤应答的转录后调控中发挥作用。有趣的是，RC3H1影响NF-κB通路调节因子如IκBα和A20的表达。RC3H1利用ROQ和锌指结构域接触A20 3′UTR中的一个结合位点，展示了一种尚未被认识的RC3H1结合模式。敲低RC3H1导致A20蛋白表达增加，从而干扰IκB激酶和NF-κB活性，证明RC3H1能够调节IKK/NF-κB通路的活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RC3H1如何识别其mRNA靶标，以及RC3H1对NF-κB通路调节因子（如A20）的转录后调控是否影响IKK/NF-κB通路活性。
- 核心机制
- RC3H1通过ROQ和CCCH型锌指结构域结合A20 3′UTR中的非CDE型茎环结构及上游AU富集序列，促进A20 mRNA衰变，降低A20蛋白表达，从而减弱对IKK的抑制并调节IKK/NF-κB活性。
- 主要证据
- PAR-CLIP鉴定出3,821个转录本上的16,234个RC3H1结合位点；SILAC和共免疫沉淀证明RC3H1与CCR4-CAF1-NOT去腺苷酸酶复合物相互作用；mRNA半衰期和pSILAC实验显示RC3H1敲低降低靶mRNA衰变速率并增加蛋白合成；EMSA证明RC3H1-N2通过CCCH型锌指结构域高亲和力结合A20茎环及上游序列；Western blot和EMSA显示RC3H1诱导降低A20蛋白并增加IKK磷酸化，敲低则增加A20蛋白并降低IKK和NF-κB活性。
- 研究意义
- 研究揭示了RC3H1全新的顺式作用识别元件和结合模式，并表明RC3H1通过转录后调控A20等NF-κB通路调节因子来调节IKK/NF-κB活性；作者提出利用反义技术靶向RC3H1-A20 mRNA相互作用并上调A20蛋白可能在特定疾病场景中具有有益结果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RC3H1结合基序与二级结构分析
确定RC3H1识别的序列和结构特征。
以优选交联位点为中心取41-nt窗口进行7mer出现频率和富集分析，并与所有3′UTR序列比较；用Vienna RNA package计算碱基配对概率；用LocARNA、RNAclust和CMfinder鉴定结构化基序。
鉴定RC3H1蛋白相互作用组
确定RC3H1是否与mRNA衰变机器相互作用。
将对照和FLAG/HA-RC3H1表达细胞等量混合，NP40裂解后经RNase T1/I处理破坏RNA介导的相互作用，FLAG和HA亲和纯化后进行SILAC定量质谱；并通过共转染myc-RC3H1与HA-CNOT1、HA-CNOT8或HA-QKI进行共免疫沉淀验证。
评估RC3H1对靶mRNA稳定性和蛋白合成的影响
验证RC3H1结合是否导致靶mRNA不稳定及蛋白合成改变。
进行全转录组mRNA半衰期测定，比较RC3H1结合与未结合转录本的半衰期；在RC3H1/RC3H2敲低后使用放线菌素D阻断转录并测序计算mRNA衰变速率；用pSILAC定量蛋白质组学检测RC3H1敲低后新合成蛋白的变化。
验证RC3H1对DNA损伤诱导转录本和A20的调控
检验RC3H1是否调控DNA损伤应答mRNA及A20表达和稳定性。
将RC3H1 PAR-CLIP靶标与neocarzinostatin诱导DNA损伤后的mRNA表达数据关联；在诱导RC3H1表达的HEK293细胞中检测A20 mRNA水平；用放线菌素D检测A20 mRNA半衰期；用靶向A20茎环的反义LNA阻断RC3H1结合并检测A20 mRNA半衰期。
解析RC3H1与A20 3′UTR的结合模式
确定RC3H1结合A20 3′UTR所需的蛋白结构域和RNA序列/结构特征。
将含A20结合位点的37-bp序列克隆至d2GFP报告基因3′UTR，在mock或RC3H1/RC3H2敲低细胞中检测报告mRNA衰变；表达重组RC3H1-N1（aa 2–399，含RING和ROQ）和RC3H1-N2（aa 2–452，含RING、ROQ和CCCH型锌指），与ICOS 13-nt、A20 21-nt茎环和A20 37-nt ARE-茎环进行EMSA；用突变序列和反义LNA进行竞争/特异性分析。
评估RC3H1对IKK/NF-κB通路的影响
验证RC3H1介导的A20调控是否影响IKK和NF-κB活性。
在诱导RC3H1表达或敲低RC3H1/RC3H2的HEK293细胞中，用TNFα刺激后通过Western blot检测A20、磷酸化IKK、总IKK、磷酸化p65、p65和IκBα，通过EMSA检测NF-κB DNA结合活性；并建立数学模型模拟RC3H1对IKK/NF-κB动力学的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
鉴定RNA结合位点与靶标
验证蛋白相互作用
验证RNA-蛋白结合
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗HA.11抗体 | Covance | 16B12 |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗myc抗体 | Sigma | 9E10 | |
| 抗γH2AX抗体 | Upstate | JBW301 | |
| 抗vinculin抗体 | Sigma | hVIN-1 | |
| 抗RC3H1抗体 | Novus | NB100–655 | |
| 抗A20抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32525 | |
| 抗磷酸化IKK抗体 | Cell Signal Technology | 2,697 | |
| 抗IKKα抗体 | BD Pharmingen | 5,56,532 | |
| 抗IκBα抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-371 | |
| 抗p65抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8008P | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 山羊抗小鼠或抗兔免疫球蛋白/辣根过氧化物酶 | Dako | -- | |
| PAR-CLIP | RNase T1 | Fermentas | -- |
| 蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma | -- | |
| Flag磁珠 | Sigma | -- | |
| 小牛肠碱性磷酸酶 | NEB | -- | |
| T4多核苷酸激酶 | Fermentas | -- | |
| 蛋白酶K | Roche | -- | |
| NuPAGE凝胶 | Invitrogen | -- | |
| HighSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| Genome Analyzer II测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | Flp-In 293 T-REx细胞 | Invitrogen | -- |
| 杀稻瘟菌素 | Invivogen | -- | |
| 潮霉素 | Invivogen | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pENTR4载体 | Invitrogen | -- |
| GATEWAY LR重组酶 | Invitrogen | -- | |
| pOG44质粒 | Invitrogen | -- | |
| d2GFP | Clontech | -- | |
| siRNA敲低 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| qPCR | Power SYBR Green PCR预混液 | ABI | -- |
| ABI LightCycler | ABI | -- | |
| RNA提取与反转录 | Trizol | Invitrogen | -- |
| DNase I | Invitrogen | -- | |
| Superscript III | Invitrogen | -- | |
| LNA转染 | LNA寡核苷酸 | Exiqon | -- |
| 对照LNA | Exiqon | -- | |
| DNA损伤诱导 | 新制癌菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| mRNA半衰期测定 | EZ-Link Biotin-HPDP | Pierce | -- |
| μMACS链霉亲和素磁珠和柱 | Miltenyi | -- | |
| RNeasy MinElute离心柱 | Qiagen | -- | |
| Affymetrix单循环靶标标记试剂盒 | Affymetrix | -- | |
| Affymetrix Human Gene 1.0 ST芯片 | Affymetrix | -- | |
| 高通量测序 | TruSeq RNA样本制备v2试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 定量蛋白质组学 | LysC蛋白酶 | Wako | -- |
| 固定化胰蛋白酶 | Applied Biosystems | -- | |
| nanoLC-Ultra 1D液相色谱 | Eksigent | -- | |
| LTQ-Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo | -- | |
| Reprosil-AQ C18填料 | Dr Maisch | -- | |
| 蛋白互作 | FLAG磁珠 | Sigma | -- |
| μMACS HA磁珠 | Miltenyi | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| 重组蛋白表达 | pQLinkH载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌Rosetta 2 (DE3) | Novagen | -- | |
| HisTrap FF crude柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 prep grade柱 | GE Healthcare | -- | |
| Source 30S柱 | GE Healthcare | -- | |
| EMSA | [γ-32P]-ATP | -- | -- |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Whatman | -- |
| ECL检测试剂 | GE Healthcare | -- | |
| LAS-4000成像系统 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PAR-CLIP | 4SU/6SG标记浓度（100 μM）和时间（8–9 h）；RNase T1处理浓度和时间（1 U/μl 15 min，或10 U/μl 2 min）；免疫沉淀抗体和 beads；测序平台与读长 阅读提示：Methods“PAR-CLIP”小节及Supplementary Table 1 |
| RC3H1敲低 | siRNA序列、终浓度（50 nM）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、敲低时间及RC3H2共敲低策略 阅读提示：Methods“Oligonucleotides”“siRNA knockdown and pSILAC”小节 |
| mRNA衰变检测 | 放线菌素D浓度（5 μg/ml或50 μg/ml）、取样时间点（0、2、4 h或0、1、2 h）、归一化内参（RPL18A）及生物学重复数 阅读提示：Methods“mRNA decay measurement by qRT–PCR”“mRNA half-life and decay measurements”小节 |
| A20 3′UTR报告基因与LNA实验 | 37-nt A20序列、d2GFP报告载体、LNA序列（+表示LNA修饰）、LNA终浓度（100 nM）、neocarzinostatin浓度（250 ng/ml）及处理时间 阅读提示：Methods“LNA transfection”“Plasmids”小节及Figure 5b、Figure 4e图注 |
| EMSA | RNA探针序列（ICOS 13-nt、A20 21-nt、A20 37-nt、Mut1-3）、重组蛋白片段（RC3H1-N1 aa 2–399、RC3H1-N2 aa 2–452）、结合缓冲液组成、凝胶浓度和电泳条件 阅读提示：Methods“Electrophoretic mobility shift assay”“Recombinant protein expression and purification”小节及Figure 5c–e图注 |
| TNFα刺激与IKK/NF-κB通路检测 | TNFα浓度（10 ng/ml）和处理时间；多西环素诱导RC3H1浓度（1 μg/ml）和时长（72 h）；Western blot抗体；EMSA NF-κB探针序列 阅读提示：Methods“Antibodies”“Electrophoretic mobility shift assay”小节及Figure 6c–f图注 |