检测ApoE−/−小鼠中Pak1表达和活性
验证Pak1在动脉粥样硬化模型中的表达和活性变化。
分析24周龄雌性和雄性ApoE−/−与C57BL/6小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞中Pak1-4水平及活性，并用免疫荧光检测主动脉根部pPak1与SMCα-actin或Mac3的共定位。
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p21激活激酶1基因敲除减轻载脂蛋白E缺陷小鼠的动脉粥样硬化
Disruption of p21-activated kinase 1 gene diminishes atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.
实验完整度
高包含ApoE−/−与Pak1−/−杂交小鼠体内模型、原代巨噬细胞和平滑肌细胞体外功能验证、机制分子检测及人动脉样本免疫荧光验证
主要模型
ApoE−/−:Pak1−/−小鼠 ApoE−/−小鼠 小鼠腹腔巨噬细胞 小鼠主动脉平滑肌细胞
重点核对
ApoE−/−和ApoE−/−:Pak1−/−雄性小鼠8周龄起喂食Western diet 16周 Western diet配方：21%脂肪和0.2%胆固醇 MCP-1诱导巨噬细胞迁移浓度50 ng/ml，孵育8小时 OxLDL处理浓度10 μg/ml，处理6小时 胆固醇（40 μg/ml）、IL-6（20 ng/ml）或MCP-1（20 ng/ml）处理6小时
摘要
Pak1在多种细胞过程中发挥重要作用，包括细胞运动、极性、存活和增殖。迄今为止，其在动脉粥样硬化形成中的作用尚未被探索。在此，我们利用易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E缺陷（ApoE−/−）小鼠作为模型，报道Pak1对动脉粥样硬化的影响。在ApoE−/−小鼠中敲除Pak1导致斑块负荷减少，显著降低循环IL-6和MCP-1水平，限制黏附分子的表达并减少ApoE−/−小鼠主动脉根部的巨噬细胞含量。我们还观察到，与ApoE−/−小鼠相比，ApoE−/−:Pak1−/−小鼠的巨噬细胞和平滑肌细胞对氧化LDL的摄取减少，胆固醇外流增加。此外，我们在人动脉粥样硬化动脉中检测到Pak1磷酸化增加，提示其在人动脉粥样硬化形成中的作用。总之，这些结果确定Pak1是动脉粥样硬化形成起始和进展中的重要参与者。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Pak1在动脉粥样硬化形成中是否发挥作用及其作用机制。
- 核心机制
- Pak1通过影响IL-6和MCP-1表达、黏附分子表达以及CD36和ABCA1水平，促进单核细胞募集、OxLDL摄取并抑制胆固醇外流，从而参与动脉粥样硬化起始和进展。
- 主要证据
- ApoE−/−:Pak1−/−小鼠斑块负荷减少约51%（en face）和44%（主动脉根部），循环IL-6和MCP-1降低50%，巨噬细胞CD36表达和OxLDL摄取减少，ABCA1表达和胆固醇外流增加；人动脉粥样硬化动脉中pPak1和CD36表达增加。
- 研究意义
- 确定Pak1是动脉粥样硬化形成起始和进展中的重要参与者，提示其可能成为人动脉粥样硬化的关键蛋白激酶之一。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建ApoE−/−:Pak1−/−小鼠并评估动脉粥样硬化
验证Pak1缺失对动脉粥样硬化斑块负荷和组成的影响。
将Pak1−/−小鼠与ApoE−/−小鼠杂交获得ApoE−/−:Pak1−/−小鼠，喂食Western diet 16周后，通过en face油红O染色和主动脉根部油红O染色评估斑块面积，免疫组化检测Mac3巨噬细胞含量，免疫荧光检测CD36和Filipin胆固醇沉积。
检测Pak1缺失对炎症因子和黏附分子表达的影响
验证Pak1缺失是否改变循环炎症因子、趋化因子及主动脉黏附分子和脂质转运相关分子的表达。
用ELISA检测血浆IL-6、IL-10、IL-12、IL-17A、IFNγ、TNFα、G-CSF、GM-CSF和MCP-1水平，用QRT-PCR检测主动脉弓IL-6、MCP-1等mRNA水平，用Western blot检测ICAM1、VCAM1、CD36、SR-B1和ABCA1蛋白表达。
评估Pak1缺失对巨噬细胞功能的影响
验证Pak1缺失是否影响巨噬细胞炎症因子产生、迁移、黏附及脂质摄取和外流。
分离腹腔巨噬细胞，用QRT-PCR和FACS检测IL-6等表达，用Boyden chamber检测MCP-1诱导的迁移，用荧光法检测对小鼠胰腺内皮细胞单层的黏附，用FACS检测CD36和Dil-OxLDL摄取，用[3H]-胆固醇检测胆固醇外流，用Western blot检测ICAM1、VCAM1、CD36、SR-B1和ABCA1。
评估Pak1缺失对平滑肌细胞功能的影响
验证Pak1缺失是否影响平滑肌细胞炎症因子表达、迁移及泡沫细胞形成。
分离主动脉平滑肌细胞，用SMCα-actin鉴定纯度，用FACS检测IL-6表达，用伤口愈合实验检测迁移，用Western blot检测CD36、SR-B1、ICAM1、VCAM1和ABCA1，用FACS和油红O染色检测Dil-OxLDL/OxLDL摄取，用[3H]-胆固醇检测胆固醇外流。
检测单核细胞亚群和单核细胞黏附
验证Pak1缺失对单核细胞亚群分布及单核细胞与主动脉黏附的影响。
用FACS分析Western diet喂养的ApoE−/−和ApoE−/−:Pak1−/−小鼠血液和主动脉中CD11b+单核细胞亚群（Ly6Chi和Ly6Clo），用离体黏附实验检测BCECF标记的WT或Pak1−/−单核细胞与ApoE−/−或ApoE−/−:Pak1−/−主动脉的黏附。
检测人动脉粥样硬化动脉中Pak1磷酸化和CD36表达
验证Pak1磷酸化在人动脉粥样硬化病变中的变化。
获取人正常和动脉粥样硬化左前降支动脉切片，用免疫荧光检测pPak1与SMCα-actin、Mac3或CD31的共定位，以及CD36与SMCα-actin或Mac3的共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和组织消化 | 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9891 |
| XI型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5307 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| 激酶实验 | 髓鞘碱性蛋白 | Sigma-Aldrich | M1891 |
| 免疫荧光和Western blot | 抗SMα-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A2547 |
| Western blot和免疫荧光 | 抗CD36抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-260 |
| Western blot | 抗ICAM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-1511-R |
| 免疫组化和免疫荧光 | 抗Mac3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-19991 |
| Western blot | 抗SR-B1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-67099 |
| 抗β-tubulin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9104 | |
| 抗VCAM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8304 | |
| 抗ABCA1抗体 | Abcam | ab18180 | |
| 免疫荧光 | 抗pPak1抗体 | Abcam | ab2477 |
| Western blot | 抗Pak1抗体 | Cell Signaling Technology | 2602 |
| 抗Pak2抗体 | Cell Signaling Technology | 2608 | |
| 抗Pak3抗体 | Cell Signaling Technology | 2609 | |
| 抗Pak4抗体 | Cell Signaling Technology | 3242 | |
| 胆固醇外流实验 | 载脂蛋白 | Biomedical Technologies | BT927 |
| OxLDL摄取实验 | 高TBAR Dil标记氧化LDL | Biomedical Technologies | BT-920 |
| 细胞处理 | 高TBAR氧化LDL | Biomedical Technologies | BT-910 |
| 流式细胞术 | 抗CD11b-APC抗体 | BD Pharmingen | 553312 |
| 抗CD49b-PE抗体 | BD Pharmingen | 553858 | |
| 抗I-A(b)-生物素抗体 | BD Pharmingen | 550553 | |
| 抗IL-6抗体 | BD Pharmingen | 559068 | |
| 抗Ly6C-FITC抗体 | BD Pharmingen | 553104 | |
| 抗Ly6G-PE抗体 | BD Pharmingen | 551461 | |
| 抗NK-T-PE抗体 | BD Pharmingen | 550082 | |
| 抗CD11c-生物素抗体 | eBiosciences | 13-0114 | |
| 抗CD45R(B220)-PE抗体 | eBiosciences | 12-0452 | |
| 抗CD90.2-PE抗体 | eBiosciences | 12-0902 | |
| 抗F4/80-生物素抗体 | eBiosciences | 13-4801 | |
| 免疫组化 | ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| DAB试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| 免疫荧光 | Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 3570 | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| 细胞迁移实验 | 重组小鼠MCP-1 | R&D Systems | 470-JE |
| ELISA | 小鼠/大鼠MCP-1 quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | MJE00 |
| 激酶实验 | [γ-32P]-ATP | MP Biomedicals | -- |
| 胆固醇外流实验 | [3H]-胆固醇 | PerkinElmer | -- |
| Western blot | 增强化学发光Western blot检测试剂 | GE Healthcare Lifesciences | RPN2106 |
| 免疫沉淀 | Protein A-Sepharose | GE Healthcare Lifesciences | CL-4B |
| Protein G-Sepharose | GE Healthcare Lifesciences | CL-4B | |
| RNA提取 | RNeasy纤维组织小型提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RiboPure试剂盒 | Ambion | -- | |
| 逆转录 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| QRT-PCR | 小鼠IL-6 TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm00446190_m1 |
| 小鼠IL-12 TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm00434165_m1 | |
| 小鼠TNFα TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm00443260_g1 | |
| 小鼠MCP-1 TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm00441242_m1 | |
| 小鼠Rantes TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm01302427_m1 | |
| 小鼠β-actin TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | Mm02619580_g1 | |
| 血浆采集 | BD Vacutainer Plus血浆采集管 | BD Biosciences | 367960 |
| 血浆细胞因子检测 | 多分析物ELISArray试剂盒 | Qiagen | MEM-004A |
| 血浆脂质检测 | Roche Diagnostics COBAS MIRA分析仪 | Roche Diagnostics | -- |
| 流式细胞术 | FACS calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACS AriaII细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 单核细胞分离 | CD115阳性单核细胞分离亲和珠 | Miltenyi Biotec | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与饮食 | ApoE−/−和ApoE−/−:Pak1−/−小鼠性别（雄性）、起始周龄（8周）、Western diet喂养时长（16周）及 diet 配方（21%脂肪和0.2%胆固醇） 阅读提示：Methods-Animals；Results-Pak1 deficiency diminishes atherosclerosis in ApoE−/− mice |
| 巨噬细胞迁移实验 | MCP-1浓度（50 ng/ml）、孵育时间（8小时）、细胞接种密度（5×10^4 cells/insert）及膜孔径（8 μm） 阅读提示：Methods-Cell migration；Figure 4c legend |
| OxLDL摄取和泡沫细胞形成 | OxLDL或Dil-OxLDL浓度（10 μg/ml）、处理时间（6小时）及检测方法（FACS或油红O染色） 阅读提示：Methods-Dil-OxLDL uptake assay；Methods-Foam cell formation assay；Figure 4g和Figure 5f–h legend |
| 胆固醇外流实验 | [3H]-胆固醇浓度（1 μCi/ml）、孵育时间（24小时）、Apolipoprotein A-I浓度（10 μg/ml）及外流时间（4小时） 阅读提示：Methods-Cholesterol efflux assay；Figure 4h和Figure 5h legend |
| 巨噬细胞处理实验 | 胆固醇（40 μg/ml）、IL-6（20 ng/ml）或MCP-1（20 ng/ml）处理时间（6小时）及Western blot检测CD36和ABCA1 阅读提示：Figure 6c legend；Results-Pak1 regulates macrophage content in aortas of ApoE−/− mice |
| 离体单核细胞黏附实验 | 单核细胞来源（C57BL/6或Pak1−/−小鼠）、标记浓度（BCECF-AM 10 μM）、黏附时间（1小时）及主动脉来源（ApoE−/−或ApoE−/−:Pak1−/−小鼠） 阅读提示：Methods-Ex vivo monocyte adhesion assay；Figure 6 legend |
| 人动脉样本免疫荧光 | 样本来源（人正常和动脉粥样硬化左前降支动脉尸检样本）、年龄范围（21至71岁）、抗原修复条件（99°C 30分钟）及抗体稀释比例 阅读提示：Methods-Human normal and atherosclerotic artery specimen；Methods-Immunofluorescence staining；Figure 8 legend |