显微切割卵巢肿瘤基质并鉴定基质基因特征
确定HGSC基质成分中差异表达的分泌蛋白基因并筛选候选分子。
对卵巢肿瘤组织的基质与上皮成分进行显微切割，提取RNA并行GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0芯片转录组分析，鉴定CAFs中上调的分泌蛋白编码基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
钙依赖性FAK/CREB/TNNC1信号介导基质MFAP5对卵巢癌转移潜能的效应
Calcium-dependent FAK/CREB/TNNC1 signalling mediates the effect of stromal MFAP5 on ovarian cancer metastatic potential.
实验完整度
高含显微切割组织转录组、细胞系体外功能、Matrigel plug体内模型、原位瘤siRNA治疗及患者组织预后分析，具备功能与机制验证
主要模型
A224和ALST卵巢癌细胞系 OVCA432卵巢癌细胞系 卵巢癌相关成纤维细胞（CAFs）与正常卵巢成纤维细胞 nude小鼠Matrigel plug及原位卵巢癌模型 HGSC患者肿瘤组织样本
重点核对
显微切割基质与上皮成分及正常卵巢基质中MFAP5 mRNA表达比较 130例晚期HGSC组织基质MFAP5免疫组化评分与生存的Kaplan-Meier及Cox回归分析 CAF共培养及recMFAP5处理中anti-MFAP5、anti-αVβ3抗体对癌细胞运动的阻断 BAPTA/AM、FAK抑制剂、ERK抑制剂、CBP/CREB抑制剂对MFAP5诱导TNNC1表达及运动的阻断 Mfap5 siRNA/壳聚糖纳米颗粒尾静脉注射对原位瘤转移结节、肿瘤重量和腹水体积的影响
摘要
卵巢癌是美国最致命的妇科恶性肿瘤，晚期浆液性卵巢腺癌导致了大多数卵巢癌死亡。然而，调节患者生存的基质来源分子决定因素尚未被表征。本文利用显微切割的卵巢肿瘤基质样本，鉴定了晚期高级别浆液性卵巢癌的基质基因特征，发现基质微纤维相关蛋白5（MFAP5）是预后不良的标志物。进一步的功能研究显示，FAK/CREB/TNNC1信号通路介导MFAP5对卵巢癌细胞运动和侵袭潜能的影响。利用封装于壳聚糖纳米颗粒中的MFAP5特异性siRNA靶向基质MFAP5，可显著降低体内卵巢肿瘤生长和转移，提示其可能成为卵巢癌治疗的新方式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 晚期高级别浆液性卵巢癌的基质基因特征是什么，基质MFAP5是否影响患者生存及其促进卵巢癌转移的分子机制为何。
- 核心机制
- CAF来源MFAP5结合αVβ3整合素，激活钙依赖性FAK/PLC-γ1/PKCθ、ERK/CREB及c-Jun通路，上调TNNC1表达并促进F-actin应力纤维形成与牵引力，从而增强卵巢癌细胞运动和侵袭。
- 主要证据
- 显微切割组织转录组与免疫组化显示CAF高表达MFAP5且高基质MFAP5与不良生存相关；体外共培养、recMFAP5处理、siRNA及通路抑制剂实验验证αVβ3–FAK/CREB/TNNC1轴；Matrigel plug与原位瘤Mfap5沉默实验显示体内侵袭和转移改变。
- 研究意义
- 提示基质MFAP5是卵巢癌预后标志物，利用壳聚糖纳米颗粒递送MFAP5特异性siRNA靶向肿瘤基质可能成为卵巢癌治疗的新方式。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MFAP5在CAFs中的表达及临床预后意义
确认MFAP5在卵巢癌基质中的表达水平及其与患者生存的关系。
通过定量RT-PCR、免疫组化和Western blot比较CAF、正常卵巢成纤维细胞及卵巢癌细胞中MFAP5表达；对晚期HGSC组织进行MFAP5免疫组化并分析生存。
体外验证MFAP5对卵巢癌细胞运动和侵袭的影响
确定CAF来源及外源MFAP5是否增强卵巢癌细胞运动和侵袭，以及是否依赖αVβ3整合素。
将CAF793092与A224、ALST细胞共培养，或在Boyden chamber及Matrigel invasion chamber中加入recMFAP5，并用anti-MFAP5、anti-αVβ3、anti-α5抗体或对照IgG处理，计数迁移和侵袭细胞。
体内验证基质MFAP5对癌细胞侵袭的作用
评估MFAP5过表达成纤维细胞是否促进卵巢癌细胞向Matrigel plug内侵袭。
将NOF151-LvMFAP5或对照NOF151细胞与Matrigel混合后腹腔注射形成plug，次日腹腔注射A224或OVCA432细胞，收获plug后行细胞角蛋白18和MFAP5免疫定位并计数侵袭细胞。
体内沉默基质Mfap5评估肿瘤生长和转移
验证靶向基质MFAP5对卵巢癌原位瘤生长和转移的治疗效果。
将荧光素酶标记的OVCA432ip细胞注入小鼠左卵巢，一周后每周两次尾静脉注射壳聚糖纳米颗粒封装的Mfap5靶向siRNA或非靶向siRNA，监测生物发光并于终点解剖评估转移。
解析MFAP5下游钙依赖性信号及TNNC1效应
确定介导MFAP5促运动和侵袭效应的信号通路与效应分子。
对recMFAP5处理的OVCA432细胞行转录组和通路分析，结合定量RT-PCR、Western blot、siRNA、通路抑制剂、钙染料、F-actin染色及牵引力显微镜验证FAK/PLC-γ1/PKCθ/ERK/CREB/c-Jun/TNNC1轴。
验证TNNC1与基质MFAP5的临床相关性
评估肿瘤TNNC1表达与基质MFAP5表达及患者生存的关系。
对107例晚期HGSC肿瘤切片行TNNC1和MFAP5免疫组化，分析两者表达相关性及TNNC1与生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转录组芯片分析 | GeneChip人类基因组U133 Plus 2.0芯片 | Affymetrix Inc. | -- |
| 流体处理站450 | Affymetrix Inc. | -- | |
| GeneChip扫描仪3000 7G | Affymetrix Inc. | -- | |
| 定量RT-PCR | MFAP5 TaqMan基因表达检测试剂 | Life Technologies Corp. | Hs00185803_m1 |
| TNNC1 TaqMan基因表达检测试剂 | Life Technologies Corp. | Hs00896999_g1 | |
| 亲环素A TaqMan基因表达检测试剂 | Life Technologies Corp. | Hs99999904_m1 | |
| 小鼠Mfap5 TaqMan基因表达检测试剂 | Life Technologies Corp. | Mm00489404_m1 | |
| Western blot | iBlot Western blot转膜系统 | Life Technologies Corp. | -- |
| 抗人MFAP5抗体 | Sigma-Aldrich | HPA010553 | |
| 抗p-FAK抗体（Y861） | Life Technologies Corp. | 44-626G | |
| 抗FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3285 | |
| 抗PLC-γ1抗体 | Cell Signaling Technology | 2822 | |
| 抗p-PLC-γ1抗体（T783） | Cell Signaling Technology | 2821 | |
| 抗PKCθ抗体 | Cell Signaling Technology | 2059 | |
| 抗p-PKCθ抗体（T538） | Cell Signaling Technology | 9377 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗p-ERK1/2抗体（T202/204） | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9197 | |
| 抗p-CREB抗体（S133） | Cell Signaling Technology | 9198 | |
| 抗c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| 抗p-c-Jun抗体（S63、S73、S243） | Cell Signaling Technology | 2361, 9164, 2994 | |
| 山羊抗兔IR染料偶联二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 通路抑制实验 | PLC抑制剂U73122 | Santa Cruz Biotechnology | sc-3574 |
| PKCθ假底物抑制剂 | Santa Cruz Biotechnology | sc-3097 | |
| ERK抑制剂II FR180204 | Santa Cruz Biotechnology | sc-203945 | |
| FAK抑制剂SU6656 | Sigma-Aldrich | S9692 | |
| c-Jun抑制剂SP600125 | Sigma-Aldrich Co. | -- | |
| CBP/CREB相互作用抑制剂 | EMD Millipore Corp. | 217505 | |
| 免疫组化 | 抗MFAP5抗体 | Sigma-Aldrich Co. | HPA010553 |
| 抗TNNC1抗体 | Sigma-Aldrich Co. | WH0007134M1 | |
| Warp Red显色试剂盒 | Biocare Medical | -- | |
| 细胞运动实验 | 钙黄绿素AM | Life Technologies Corp. | -- |
| 单克隆抗αVβ3抗体 | EMD Millipore Corp. | MAB1976Z | |
| 抗α5抗体 | BD Bioscience | 555615 | |
| 钙螯合处理 | BAPTA/AM钙螯合剂 | Life Technologies | B-6769 |
| MFAP5过表达成纤维细胞构建 | MFAP5开放阅读框慢病毒表达克隆 | GeneCopoeia | EX-D0360-Lv105 |
| 细胞增殖检测 | xCELLigence实时细胞分析系统 | Roche Applied Bioscience | -- |
| 体内生物发光成像 | IVIS-200生物发光与荧光成像系统 | Caliper Life Sciences, Inc. | -- |
| F-actin染色 | Alexa Fluor 594鬼笔环肽 | Life Technologies Corp. | -- |
| 蛋白分级提取 | NE-PER核质蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| Western blot检测TNNC1 | 兔抗人TNNC1多克隆抗体 | Proteintech | 13504-1-AP |
| 牵引力显微镜 | FluoSpheres荧光微球（0.2 µm，黄绿色） | Life Technologies | -- |
| I型胶原 | BD Bioscience | -- | |
| sulfo-SANPAH交联剂 | Pierce Chemical | -- | |
| 钙成像与牵引力显微镜 | TCS SP5共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 钙成像 | Fluo-4 AM钙染料 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织转录组分析 | 显微切割样本来源与数量（33例患者肿瘤及CAFs、8例正常卵巢基质、6例正常卵巢表面上皮）、差异表达统计阈值p<0.05及FDR校正 阅读提示：Methods“Microdissection and transcriptome profiling of tissue samples”及Figure 1A、Table 1 |
| 基质MFAP5预后分析 | 130例晚期HGSC FFPE样本、MFAP5抗体浓度1:500、染色强度与阳性基质百分比评分方法、高/低表达按中位数划分 阅读提示：Methods“Immunohistochemical analysis”及Figure 1E |
| 体外运动和侵袭实验 | 细胞系A224、ALST、OVCA432，CAF793092接种密度5×10^4/孔，recMFAP5浓度（运动500 ng/mL、侵袭200 ng/mL），抗体10 µg/mL，孵育15小时，独立重复3次 阅读提示：Methods“CAF-derived MFAP5-stimulated motility of ovarian cancer cells”“Recombinant MFAP5-increased ovarian cancer cell motility”“MFAP5-stimulated ovarian cancer cell invasion”及Figure 2 |
| Matrigel plug体内侵袭模型 | 6周龄雌性nude小鼠、每只500 µl Matrigel混合物、1×10^6个癌细胞、A224和OVCA432分别48和72小时收获、每组每种细胞系n=10 阅读提示：Methods“MFAP5 stimulated cancer cell migration and invasion in vivo”及Figure 2E–2G |
| 原位瘤Mfap5沉默治疗实验 | OVCA432ip细胞左卵巢注射、siRNA/壳聚糖纳米颗粒尾静脉每周两次共7周、每组N=9–10、第6周生物发光检测、第8周解剖 阅读提示：Methods“In vivo Mfap5 silencing-reduced tumor growth and metastasis”及Figure 3 |
| 信号通路机制实验 | recMFAP5 200 ng/mL、BAPTA/AM 10 µM预处理1小时、各通路抑制剂种类与使用、TNNC1 siRNA、Fluo-4 AM负载及独立重复3次；各抑制剂具体浓度文中未明确说明 阅读提示：Methods“Signaling mechanism underlying MFAP5's effect on cancer cells”“MFAP5-stimulated calcium-dependent F-actin rearrangement”“Traction force microscopy”“[Ca2+]i measurement”及Supplementary Figs. 5–7 |
| TNNC1临床相关性分析 | 107例HGSC FFPE样本、anti-TNNC1抗体1:100、评分方法、Spearman相关及校正年龄和减瘤状态的Cox回归 阅读提示：Methods“Immunohistochemical analysis”及Figure 7B–7D |