LCA通过溶酶体途径激活AMPK
验证LCA是否通过溶酶体葡萄糖感知通路激活AMPK。
在MEFs中，用1 μM LCA处理4小时，检测AXIN–LKB1向溶酶体转位、AXIN–LKB1与v-ATPase–Ragulator复合物形成、v-ATPase活性抑制以及AMPK磷酸化；并利用ATP6V0C敲低、Axin1或Lamtor1敲除细胞和小鼠验证。
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石胆酸结合TULP3激活sirtuins和AMPK以减缓衰老
Lithocholic acid binds TULP3 to activate sirtuins and AMPK to slow down ageing.
实验完整度
高包含MEFs、HEK293T细胞、小鼠、线虫和果蝇多模型，并有功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） HEK293T细胞 老年小鼠肌肉特异性V1E1(3KR)表达模型 秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇
重点核对
LCA处理浓度1 μM、时间4 h（细胞实验） LCA饮水给药1 g/L，包被(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，处理1个月（小鼠） V1E1 K52、K99、K191突变为精氨酸（3KR）模拟去乙酰化状态 TULP3结合LCA的解离常数Kd约15 μM TULP3(4G)突变（Y193、P195、K333、P336突变为甘氨酸）阻断LCA结合
摘要
石胆酸（LCA）在哺乳动物热量限制期间积累，并可激活AMPK以减缓衰老。然而，LCA如何激活AMPK并诱导这些生物学效应的分子细节尚不清楚。本研究表明，LCA增强sirtuins的活性，使其去乙酰化并继而抑制液泡型H+-ATP酶（v-ATPase），从而通过溶酶体葡萄糖感知通路激活AMPK。对与SIRT1共免疫沉淀的蛋白质进行蛋白质组学分析，鉴定出TUB样蛋白3（TULP3）为LCA受体。具体而言，结合LCA的TULP3变构激活sirtuins，sirtuins随后去乙酰化v-ATP酶V1E1亚基的K52、K99和K191残基。在肌肉中特异性表达模拟去乙酰化状态的V1E1突变体（3KR），可强烈激活AMPK并使老年小鼠的肌肉恢复年轻。在线虫和果蝇中，LCA分别依赖TULP3同源物tub-1和ktub来激活AMPK并延长寿命和健康寿命。我们的研究表明，LCA激活TULP3–sirtuin–v-ATPase–AMPK通路再现了热量限制的益处。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LCA如何激活AMPK并诱导延缓衰老的生物学效应？
- 核心机制
- LCA结合TULP3，变构激活sirtuins，sirtuins去乙酰化v-ATPase的V1E1亚基（K52、K99、K191），抑制v-ATPase，进而通过溶酶体葡萄糖感知通路激活AMPK。
- 主要证据
- 在MEFs、HEK293T细胞、小鼠、线虫和果蝇中，通过基因敲除、突变体表达、蛋白质组学、免疫印迹和寿命分析等实验，证明TULP3–sirtuin–v-ATPase–AMPK通路介导LCA的效应。
- 研究意义
- LCA激活TULP3–sirtuin–v-ATPase–AMPK通路再现了热量限制的益处，为延缓衰老提供了分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LCA通过去乙酰化v-ATPase V1E1亚基激活AMPK
确定v-ATPase去乙酰化在LCA激活AMPK中的作用。
对v-ATPase各亚基进行质谱分析鉴定乙酰化位点；构建V1E1的K52、K99、K191突变为精氨酸（3KR）或谷氨酰胺（3KQ）的突变体，检测AMPK激活和v-ATPase抑制；使用针对乙酰化K99的抗体检测LCA或热量限制后的去乙酰化。
sirtuins介导LCA诱导的V1E1去乙酰化和AMPK激活
验证sirtuins在LCA诱导的V1E1去乙酰化和AMPK激活中的作用。
在HEK293T细胞中过表达SIRT1–SIRT7或显性负性突变体，检测V1E1去乙酰化和AMPK激活；构建Sirt1–7–/– MEFs及单敲除细胞，检测LCA效应；并测试sirtuins对组蛋白H3K9去乙酰化的影响。
TULP3作为LCA受体介导sirtuins激活
鉴定LCA激活sirtuins所需的结合蛋白。
通过SIRT1共免疫沉淀和质谱鉴定相互作用蛋白；敲低157个候选蛋白，筛选出TULP3；验证TULP3与LCA结合（Kd约15 μM）、与sirtuins组成性结合；构建TULP3(4G)突变体阻断LCA结合；利用体外纯化蛋白和竞争实验验证。
TULP3–sirtuin–v-ATPase轴在体内介导LCA和热量限制的延缓衰老效应
验证该通路在动物模型中的生理功能。
在老年小鼠肌肉中特异性表达V1E1(3KR)或TULP3(4G)，检测AMPK激活、肌肉功能、线粒体含量和NAD+水平；在线虫和果蝇中敲除TULP3同源物或sirtuins，检测LCA对寿命和健康寿命的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Thermo | 12800082 |
| 胎牛血清 | Thermo | 10099141C | |
| LCA处理 | 石胆酸 | Sigma | L6250 |
| (2-羟丙基)-β-环糊精 | Sigma | C0926 | |
| 免疫印迹 | 抗磷酸化AMPKα-Thr172抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化ACC-Ser79抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| 抗ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3662 | |
| 抗SIRT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9475 | |
| 抗TULP3抗体 | Proteintech | 13637-1-AP | |
| 抗ATP6V1E1抗体 | Proteintech | 15280-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗LAMP2抗体 | Abcam | ab13524 |
| 抗AXIN1抗体 | Cell Signaling Technology | 2074 | |
| 抗HA标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 溶酶体pH测定 | LysoSensor Green DND-189染料 | Thermo | L7535 |
| v-ATPase活性测定 | FITC-葡聚糖 | Sigma | FD10S |
| 溶酶体分离试剂盒 | Sigma | LYSISO1 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Cytiva | 17127904 |
| 蛋白G琼脂糖4 Fast Flow | Cytiva | 17061806 | |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 28990944 |
| HIS-select镍亲和凝胶 | Sigma | P6611 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo | 15596018 |
| 逆转录定量PCR | Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液 | Thermo | K0223 |
| ReverTra Ace qPCR RT预混液（含gDNA去除剂） | Toyobo | FSQ-301 | |
| 代谢物测定 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo | -- |
| LightCycler 480 II系统 | Roche | -- | |
| QTRAP 5500质谱仪 | SCIEX | -- | |
| 耗氧率测定 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Seahorse XFe24细胞外流量分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 小鼠跑步能力测定 | 啮齿动物跑台NG | UGO Basile | 47300 |
| 小鼠握力测定 | 握力计 | Ugo Basile | 47200 |
| 体成分分析 | EchoMRI-100H分析仪 | Echo Medical Systems | -- |
| 能量消耗测定 | Promethion代谢笼系统 | Sable Systems International | -- |
| 组织学 | CM1950冷冻切片机 | Leica | -- |
| LSM980显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫荧光 | STELLARIS 8 FALCON共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| LCA探针合成 | BOP缩合剂 | Bidepharm | -- |
| 2-(3-(丁-3-炔-1-基)-3H-二氮丙啶-3-基)乙胺 | Bidepharm | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LCA处理细胞 | LCA浓度1 μM、处理时间4小时、溶剂DMSO 阅读提示：Methods 'Formulation of LCA'和Figure legends |
| 小鼠LCA给药 | LCA包被(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，饮水浓度1 g/L，处理1个月 阅读提示：Methods 'Formulation of LCA'和Extended Data Fig. 1k-n |
| 热量限制小鼠模型 | 每日喂食2.5 g标准饲料（约70% ad libitum），持续4个月或3.5个月 阅读提示：Methods 'CR and fasting treatments of mice' |
| V1E1(3KR)突变体构建 | K52、K99、K191突变为精氨酸，通过Rosa26-LSL系统在肌肉特异性表达，16个月龄时他莫昔芬诱导 阅读提示：Methods 'Mouse strains'和Figure 4a |
| TULP3(4G)突变体构建 | Y193、P195、K333、P336突变为甘氨酸，用于阻断LCA结合 阅读提示：Methods 'Determination of the binding sites of TULP3 for LCA'和Fig. 3f |
| 线虫寿命分析 | LCA浓度100 μM，从L4期开始给药，每2天转移至新板 阅读提示：Methods 'Evaluation of lifespan and healthspan in nematodes' |
| 果蝇寿命分析 | LCA浓度100 μM，在标准玉米粉培养基中给药，每2天转移 阅读提示：Methods 'Evaluation of lifespan and healthspan of flies' |
| SIRT1活性测定 | 使用乙酰化组蛋白H3肽或乙酰化V1E1肽作为底物，LCA浓度5 μM，25°C反应15分钟 阅读提示：Methods 'Determination of SIRT1 activity' |