GATOR2复合物的表达与纯化
获得用于结构解析和生化分析的高纯度GATOR2复合物。
在悬浮适应的HEK293T细胞中共表达五个亚基，通过抗Flag亲和层析和尺寸排阻色谱纯化复合物。
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营养感知枢纽GATOR2的结构
Structure of the nutrient-sensing hub GATOR2.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、体外生化实验、细胞水平功能验证及多种突变体分析，具有多层级证据和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞（悬浮适应型） 纯化的人GATOR2复合物 GATOR2敲除或敲低HEK293T细胞系
重点核对
GATOR2复合物纯度及组分化学计量比（SDS-PAGE和SEC） 冷冻电镜数据采集参数及三维重构分辨率（整体3.7 Å） 氨基酸饥饿60分钟及再刺激15分钟的处理条件 TAK-243处理浓度0.5 μM及时间4小时 体外泛素化反应中GATOR1和GATOR2的浓度（500 nM和250 nM）
摘要
机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通过响应包括营养素在内的环境信号来调控合成代谢和分解代谢过程，从而控制生长。氨基酸通过Rag GTP酶向mTORC1传递信号，而Rag GTP酶受包括GATOR1和GATOR2在内的多个蛋白复合物调控。GATOR2具有五个组分（WDR24、MIOS、WDR59、SEH1L、SEC13），是氨基酸激活mTORC1所必需的，并分别与亮氨酸和精氨酸传感器Sestrin2和CASTOR1相互作用。尽管GATOR2在营养感知中具有核心作用，但其亚基化学计量、生化功能和结构仍不清楚。在这里，我们使用电子冷冻显微镜确定了人GATOR2复合物的三维结构。我们发现GATOR2采用一个大型（1.1 MDa）、两重对称、笼状架构，由一个八边形支架支撑，并装饰有八对WD40 β-螺旋桨。该支架包含两个WDR24、四个MIOS和两个WDR59亚基，通过涉及非催化RING结构域和α-螺线管的两种不同类型的连接环化。SEH1L和SEC13通过β-螺旋桨叶片捐赠整合到支架中，稳定了GATOR2复合物，并揭示了与核孔和膜涂层复合物的进化关系。支架定向WD40 β-螺旋桨二聚体，这些二聚体介导与Sestrin2、CASTOR1和GATOR1的相互作用。我们的工作揭示了营养感知机制中一个基本组分的结构，并为理解GATOR2在mTORC1通路中的功能提供了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GATOR2复合物的亚基化学计量、生化功能和三维结构尚不清楚，本研究旨在解析其结构并阐明其在mTORC1营养感知通路中的功能机制。
- 核心机制
- GATOR2通过其β-螺旋桨结构域分别与CASTOR1、GATOR1/KICSTOR和Sestrin2结合，整合亮氨酸和精氨酸可用性信号，并通过支架完整性调控mTORC1活性；其RING结构域形成锌结合二聚化界面而非泛素连接酶活性。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示GATOR2为1.1 MDa笼状八边形支架；生化实验表明MIOS、WDR59和WDR24的β-螺旋桨分别介导与CASTOR1、GATOR1/KICSTOR和Sestrin2的相互作用；CTD和α-螺线管突变破坏支架组装及mTORC1信号；体外泛素化实验未检测到GATOR2的E3连接酶活性。
- 研究意义
- 本研究揭示了营养感知机制中一个基本组分的结构，为理解GATOR2在mTORC1通路中的功能提供了基础，并提示GATOR2与膜涂层复合物存在进化关系。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定人GATOR2复合物的三维结构。
对纯化的GATOR2进行单颗粒冷冻电镜数据采集、图像处理和三维重构，并构建原子模型。
结构模型验证与突变体功能分析
验证结构观察到的界面在GATOR2组装和信号传导中的功能重要性。
构建CTD、α-螺线管和β-螺旋桨缺失或点突变体，在敲除细胞中进行免疫共沉淀和mTORC1信号检测。
GATOR2与营养传感器及GATOR1的相互作用分析
确定GATOR2各β-螺旋桨与CASTOR1、Sestrin2、GATOR1/KICSTOR的相互作用特异性。
在敲除细胞中表达β-螺旋桨缺失或单链β-螺旋桨二聚体构建体，进行免疫共沉淀和免疫印迹。
GATOR2泛素连接酶活性测试
检验GATOR2是否具有E3泛素连接酶活性。
体外泛素化实验和泛素释放实验，以及细胞用TAK-243处理后的mTORC1信号分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FreeStyle 293表达培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 灭活胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | PEI MAX 40K转染试剂 | Polysciences | -- |
| 免疫沉淀 | Dynabeads M-270环氧磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Millipore Sigma | -- | |
| Western blot | 抗S6K pT389抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 |
| 抗S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗MIOS抗体 | Cell Signaling Technology | 13557 | |
| 抗WDR59抗体 | Cell Signaling Technology | 53385 | |
| 抗NPRL2抗体 | Cell Signaling Technology | 37344 | |
| 抗RagA抗体 | Cell Signaling Technology | 4357 | |
| 抗RagC抗体 | Cell Signaling Technology | 3360 | |
| 抗ULK1 pS757抗体 | Cell Signaling Technology | 6888 | |
| 抗ULK1抗体 | Cell Signaling Technology | 8054 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Cell Signaling Technology | 14179 | |
| 抗DEPTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 11816 | |
| 抗Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 抗Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗泛素化蛋白抗体（FK2） | Millipore Sigma | 04–263 | |
| 抗UBE2D抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166278 | |
| 抗SEH1L抗体 | Abcam | ab218531 | |
| 抗DEPDC5抗体 | Abcam | ab185565, ab213181 | |
| 抗SEC13抗体 | Proteintech | 15397–1-AP | |
| 抗WDR24抗体 | Proteintech | 20778–1-AP | |
| 抗KPTN抗体 | Proteintech | 16094–1-AP | |
| 抗NRF2抗体 | Proteintech | 16396–1-AP | |
| 免疫沉淀 | Flag-M2抗体 | Millipore Sigma | F1804 |
| Western blot | 抗NPRL3抗体 | Novus Biologicals | NBP1–88447 |
| 抗Raptor抗体 | EMD Millipore | 09–217 | |
| SDS-PAGE | InstantBlue考马斯蛋白染色液 | Abcam | -- |
| 蛋白纯化 | FLAG肽 | -- | -- |
| TSKgel G4000SWxl色谱柱 | Tosoh | -- | |
| 100 kDa截留分子量离心过滤器 | Millipore | -- | |
| SDS-PAGE | 4–12% Bolt凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYPRO Ruby蛋白染色液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体外泛素化 | E2Select泛素偶联试剂盒 | R&D Systems | -- |
| UBE1 | R&D Systems | -- | |
| UBE2D3 | R&D Systems | -- | |
| 泛素 | R&D Systems | -- | |
| UBE4B | R&D Systems | -- | |
| 泛素释放实验 | 负载泛素的UBE2D3 | R&D Systems | -- |
| HOIP催化结构域 | R&D Systems | -- | |
| 细胞处理 | TAK-243 | Chemietek | -- |
| 冷冻电镜样品制备 | Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Quantifoil R 1.2/1.3多孔碳膜载网 | Quantifoil | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | Talon Arctica电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon III直接检测相机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Titan Krios电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gatan K3直接检测相机 | Gatan | -- | |
| 克隆 | Q5高保真聚合酶 | NEB | -- |
| Gibson组装试剂盒 | NEB | -- | |
| QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent | -- | |
| gBlock基因片段 | Integrated DNA Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GATOR2复合物纯化 | 转染质粒比例、细胞密度、裂解缓冲液组成、洗涤盐浓度、洗脱条件 阅读提示：参见Materials中Protein expression and purification部分 |
| 冷冻电镜数据采集与处理 | 电镜型号、相机、能量过滤器狭缝宽度、像素大小、总剂量、数据处理软件及参数 阅读提示：参见Materials中Electron cryomicroscopy和Image processing部分及Supplementary Information Table 1 |
| 氨基酸饥饿与再刺激 | 饥饿时间60分钟、再刺激时间15分钟、饥饿培养基（无氨基酸RPMI） 阅读提示：参见Materials中Transfections, cell lysis, and immunoprecipitation experiments部分 |
| TAK-243处理 | 处理浓度0.5 μM、处理时间4小时、对照DMSO 阅读提示：参见Materials中Transfections, cell lysis, and immunoprecipitation experiments部分 |
| 体外泛素化实验 | GATOR1和GATOR2浓度、E2酶组合、孵育温度37°C和时间1小时 阅读提示：参见Materials中In vitro ubiquitination assays部分 |