建立神经元顺铂DNA修复检测体系
确定顺铂损伤是否在神经元中被修复及修复的基因组分布。
用EdU Click-iT成像、核内EdU流式检测和scSAR-seq检测i3Neurons顺铂处理后的DNA修复合成。
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DNA修复驱动顺铂诱导的神经元死亡
DNA repair drives cisplatin-induced neuronal death.
实验完整度
高包含iPSC来源人神经元、原代小鼠皮层神经元、小鼠DRG及SAMHD1−/−小鼠模型，结合功能与机制验证。
主要模型
人iPSC来源的i3Neurons 原代小鼠皮层神经元 小鼠背根神经节（DRG）神经元 顺铂诱导周围神经病变小鼠模型
重点核对
i3Neurons顺铂处理：5 μM为低剂量，20 μM为中等剂量，75 μM为高剂量 原代小鼠皮层神经元顺铂处理：5 μM为中等致死剂量，20 μM为高剂量 EdU掺入检测DNA修复合成，流式细胞术以DAPI门控核内信号 γ-H2AX与53BP1免疫荧光共定位检测DNA双链断裂 小鼠顺铂给药：1.5 mg/kg每日腹腔注射5天，von Frey纤维检测机械敏感性
摘要
铂类药物是许多癌症的基石疗法，但常在有丝分裂后组织中引起神经毒性，而目前缺乏有效干预措施。这一局限反映了对神经元DNA损伤反应的理解不完整。我们表明，核苷酸切除修复（NER）介导神经元中顺铂损伤的去除；然而，与在分裂细胞中的保护作用不同，NER在神经元中促进顺铂诱导的细胞死亡。这种脆弱性源于神经元拥有低水平的脱氧核苷三磷酸（dNTP）池。dNTP最初在转录偶联NER过程中被消耗，以解决阻断转录的损伤。随着dNTP水平耗竭，修复无法完成，导致双链断裂积累，尤其是在全基因组NER过程中。补充脱氧核苷或遗传上调dNTP合成可恢复核苷酸池，保护神经元免于细胞死亡，并减少顺铂诱导的神经病理性疼痛。这些发现将有限的dNTP可用性确定为有丝分裂后细胞的关键脆弱性，并提示核苷补充作为减轻化疗诱导神经毒性的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 有丝分裂后神经元如何修复顺铂DNA损伤，以及为何修复活动反而导致细胞死亡。
- 核心机制
- 顺铂损伤先由TC-NER修复并消耗dNTP池；dNTP耗竭导致GG-NER无法完成缺口填充，积累DNA双链断裂并触发神经元死亡。
- 主要证据
- i3Neurons与原代小鼠皮层神经元中EdU掺入、scSAR-seq、γ-H2AX/53BP1染色、END-seq及dNTP定量显示NER依赖的DNA断裂；dN补充或SAMHD1缺失/RRM2B过表达提高存活；SAMHD1−/−小鼠顺铂神经病变减轻。
- 研究意义
- 提示核苷补充或提高dNTP水平可作为保护有丝分裂后组织免受化疗神经毒性的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定NER亚通路对顺铂损伤修复的贡献
明确TC-NER与GG-NER在神经元顺铂损伤修复中的相对作用。
在XPG、XPA、CSB、XPC缺失或敲低的i3Neurons及原代小鼠皮层神经元中检测EdU掺入和scSAR-seq。
验证NER对顺铂神经元毒性的影响
检验NER活性是否影响顺铂诱导的神经元死亡。
用CellTiter-Glo检测WT与NER缺陷神经元的存活，并在iPSCs中比较。
检测NER中间产物与DNA断裂形成
确定NER是否将顺铂损伤加工为单链和双链断裂。
检测染色质结合RPA、PARylation、γ-H2AX/53BP1共定位，并用END-seq和S1-END-seq全基因组定位断裂。
验证dNTP池耗竭导致修复不完全
检验dNTP可用性是否限制NER完成并导致神经元死亡。
用HPLC和HIV RT assay测定dNTP水平；用aphidicolin、HU、dN补充、SAMHD1缺失、RRM2B调控改变dNTP池并检测存活和γ-H2AX。
体内验证dNTP池对顺铂神经病变的影响
在体内检验提高dNTP池是否减轻顺铂诱导的周围神经病变。
用EdU流式检测小鼠DRG神经元DNA修复；用SAMHD1−/−与WT小鼠进行顺铂给药和von Frey机械敏感性测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证DNA断裂与修复中间产物
测定dNTP水平
评估体内神经病变
转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
| Essential 8培养基 | -- | -- | |
| ROCK抑制剂（Y-27632） | Selleckchem | S1049 | |
| 神经元分化 | 多西环素 | Clontech | 631311 |
| N2添加剂 | Life Technologies | 17502048 | |
| MEM非必需氨基酸 | Thermo Scientific | 11140050 | |
| GlutaMAX | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| 神经元培养 | 多聚-L-鸟氨酸（PLO） | Sigma | P3655 |
| BrainPhys培养基 | STEMCELL Technologies | A3582801 | |
| B27 Plus添加剂 | ThermoFisher Scientific | 450–03 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Sigma | L2020–1MG | |
| 脑源性神经营养因子 | PeproTech | 450–02 | |
| 神经营养因子-3 | PeproTech | 450–03 | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma Aldrich | 479306 |
| 2'-脱氧胞苷（dC） | Sigma Aldrich | D3897 | |
| 胸苷（dT） | Sigma Aldrich | T9250 | |
| 2'-脱氧鸟苷一水合物（dG） | Sigma Aldrich | D7145 | |
| 2'-脱氧腺苷一水合物（dA） | Sigma Aldrich | D7400 | |
| DNA修复检测 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Vector Laboratories | CCT-1149 |
| EdU成像与流式 | Click-iT EdU试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10337 |
| AZDye 488吡啶甲基叠氮化物 | Vector Laboratories | CCT-1276 | |
| 流式分析 | BD Cytofix/Cytoperm缓冲液 | BD Biosciences | 554714 |
| 细胞存活检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G8461 |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化组蛋白H2AX（Ser139）克隆JBW301 | Millipore | 05–636 |
| 抗53BP1 | Novus Biologicals | NB100–305 | |
| 抗TUBB3克隆TUJ1 | BioLegend | 98130 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔 | Invitrogen | A11011 | |
| Western blot | 抗CSB | Abcam | ab96089 |
| 抗XPA | Abcam | ab85914 | |
| 抗XPG | Bethyl | A301–484 | |
| 抗ERCC1（D-10） | Santa Cruz | sc-17809 | |
| 抗XPC（D1M5Y） | Cell Signaling | 14768 | |
| 抗RRM2B（EPR8816） | Abcam | ab154194 | |
| 抗β-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG | LI-COR | 926–32211 | |
| IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG | LI-COR | 926–68070 | |
| 流式分析 | 抗RPA32克隆4E4 | Cell Signaling Technology | 2208 |
| 抗聚ADP核糖结合试剂 | Millipore Sigma | MABE1031 | |
| Alexa Fluor 647鸡抗小鼠 | Invitrogen | A21463 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗大鼠 | Invitrogen | A21247 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗兔 | Invitrogen | A21245 | |
| DRG流式 | Alexa Fluor 647抗NeuN | Abcam | ab190565 |
| 新生RNA检测 | 5-乙炔基尿苷（EU） | Vector Laboratories | CCT-1261 |
| 线粒体检测 | 四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE） | Invitrogen | T669 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| cDNA合成 | SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher | 11754050 |
| qPCR | iTaq Universal SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725121 |
| RNA-seq | NEBNext rRNA去除试剂盒v.2（人/小鼠/大鼠） | NEB | E7400 |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | E7760 | |
| 病毒包装 | Lipofectamine 3000 | Life Technologies | L3000150 |
| 病毒浓缩 | Lenti-X浓缩试剂 | Takara Bio | 631231 |
| dNTP检测 | Affi-Gel硼酸酯凝胶 | Bio-Rad | -- |
| Oasis WAX固相萃取柱 | Waters | -- | |
| END-seq | ExoVII | NEB | M0379S |
| ExoT | NEB | M0265S | |
| USER酶 | NEB | M5505S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| i3Neurons顺铂处理与DNA修复检测 | 顺铂剂量：5、20、75 μM；EdU浓度20 μM；处理时间18–24 h；i3Neurons分化阶段day 6；流式n=3 阅读提示：STAR Methods中i3Neuron differentiation and cell culture及EdU FACS小节，Figure 1 legend |
| 原代小鼠皮层神经元顺铂处理 | 顺铂剂量：5 μM为中等致死剂量，20 μM为高剂量；EdU浓度20 μM；处理时间18–24 h；胚胎E16.5来源；n=2–3 阅读提示：STAR Methods中Primary cortical neuron cell culture及EdU FACS小节，Figure 2 legend |
| 小鼠顺铂神经病变模型 | 顺铂剂量1.5 mg/kg每日腹腔注射5天；von Frey纤维0.008–1 g，每纤维10次；n=20小鼠（每组10只，每性别5只）；行为测试盲法 阅读提示：STAR Methods中Mechanical sensitivity assessed by von Frey testing小节，Figure 7 legend |
| dNTP池调控实验 | dN浓度150 μM；aphidicolin 5 μM；HU 10 mM；顺铂剂量5、20、75 μM；处理时间2–11天 阅读提示：STAR Methods中i3Neuron differentiation and cell culture药物描述，Figure 5和Figure 6 legend |
| DRG体内EdU检测 | 顺铂15 mg/kg腹腔注射；EdU 200 mg/kg分别在收获前28、20、6小时腹腔注射；收获后28小时；n=2 阅读提示：STAR Methods中Dorsal root ganglion harvest小节，Figure 7 legend |