PathSeq-T2T流程构建与计算机模拟基准测试
评估流程从人源序列背景中检测痕量微生物信号的能力。
使用17种微生物的计算机模拟群落与人类序列按10倍梯度稀释混合（1:1至1:10^8），经PathSeq-T2T宿主过滤和分类，计算微生物读段保留率和人源读段去除率。
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多界癌症微生物组的生物多样性与生物地理学
Biodiversity and biogeography of the multi-kingdom cancer microbiome.
实验完整度
高包含体外模拟与真实DNA混合基准测试、细胞系验证及16,369例肿瘤与15,249例胚系全基因组测序分析，并有多重分类器交叉验证和独立TCGA队列验证。
主要模型
UK 100kGP肿瘤全基因组测序样本（16,369例）及匹配胚系样本（15,249例） HCT116结直肠癌细胞系 ZymoBIOMICS肠道微生物标准品（17种细菌、真菌和古菌） TCGA/TCMA肿瘤微生物组数据
重点核对
宿主过滤流程PathSeq-T2T使用T2T-CHM13参考基因组，并依次进行质量、复杂度、宿主k-mer过滤及BWA比对去除人源序列 微生物分类使用Kraken2（PlusPF数据库，置信度阈值0.15）、MetaPhlAn4（CHOCOPhlAn SGB数据库，最小读长60）和Sylph（预构建细菌、真菌和病毒数据库）三种工具交叉验证 去污染采用泛癌等流行率（PCE）评分，阈值设为0.7，但已知感染人类的病毒（HPV-16、HPV-18、MCPyV、HSV-1、EBV、CMV、HHV-6A、HHV-6B、HHV-7）例外 体外和计算机模拟稀释系列从1:1至1:10^8，每个条件约3亿条读段，体外实验设三个重复，并包含人源-only、微生物-only和无模板阴性对照 下游分析仅限于新鲜冷冻、PCR-free文库的原发或复发实体瘤样本（n=10,698），背景阈值定为0.1 RPM
摘要
微生物是肿瘤微环境的重要组成部分，但相互矛盾的报道使得跨癌种微生物普遍存在的程度仍不清楚，因此需要更稳健的方法来表征肿瘤相关微生物组。我们构建并基准测试了一个宿主减法和分类流程，用于从全基因组测序数据中识别微生物群，并将其应用于英国10万人基因组计划中16,369个高深度肿瘤全基因组。去污染后，在大多数癌症类型中，微生物特征与背景无法区分。然而，在口消化道肿瘤中，我们检测到多界多微生物群落，包括细菌、真菌、病毒、古菌，并在某些情况下检测到滴虫——一种原生动物寄生虫。这些群落因肿瘤部位和亚型而异，微卫星不稳定和POLE/POLD1突变肿瘤的微生物定植增加，这得到了口消化道癌症中微生物载量与肿瘤突变负荷之间相关性的支持。该分析有助于解决泛癌微生物结构问题，并将肿瘤微生物组与宿主表型和肿瘤基因组背景联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 解决关于肿瘤相关微生物群落跨癌种分布范围的争议，并表征癌症微生物组的生物多样性和生物地理学。
- 核心机制
- 肿瘤微生物组主要定植于口消化道黏膜屏障部位，其组成和载量受解剖部位和肿瘤基因组背景（如突变负荷）独立影响；高突变负荷可能通过肿瘤-免疫相互作用创造允许微生物扩增的微环境。
- 主要证据
- 对100kGP队列16,369个肿瘤全基因组进行PathSeq-T2T分析和去污染后，发现仅口消化道癌症（口咽、食管、胃、结直肠）保留超过背景的微生物信号，且微生物载量与肿瘤突变负荷相关；在MSI和POLE/POLD1突变结直肠癌中微生物载量显著增加，该趋势在TCGA/TCMA数据中得到验证。
- 研究意义
- 提供了高分辨率的癌症微生物组图谱，有助于解决泛癌微生物结构的持续不确定性，并确定肿瘤微生物组群落结构的表型和基因型决定因素，为未来肿瘤相关微生物的功能和机制研究以及生物标志物发现奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外微生物-人DNA混合基准测试
在真实测序数据中评估流程性能并识别样品制备引入的污染。
从HCT116细胞系提取人DNA，从ZymoBIOMICS肠道微生物标准品提取微生物DNA，按相同比例混合进行体外稀释系列测序，并设置人源-only、微生物-only和无模板阴性对照，用PathSeq-T2T分析。
结直肠癌细胞系验证
评估流程在无微生物预期的癌细胞系中的表现及PCR扩增对微生物信号的影响。
使用CCLE中结直肠癌细胞系全基因组测序数据，比较微卫星稳定（MSS；n=12）与不稳定（MSI；n=8）细胞系，以及PCR-free（n=10）与PCR扩增（n=10）文库的微生物信号。
100kGP队列微生物组检测与去污染
在真实肿瘤全基因组数据中识别微生物信号并区分污染与真实肿瘤相关微生物。
对16,369个肿瘤和15,249个胚系样本应用PathSeq-T2T，计算泛癌等流行率（PCE）评分，以0.7为阈值去除污染物种，并限制下游分析于新鲜冷冻、PCR-free的原发实体瘤样本。
口消化道癌症微生物组生物地理学与多界组成分析
表征口咽、胃食管和结直肠癌的微生物载量、多样性、物种组成及多界（细菌、真菌、古菌、病毒、寄生虫）特征。
对去污染后的口咽（n=251）、胃食管（n=199）和结直肠（n=2,422）肿瘤样本分析微生物丰度（RPM）、Shannon多样性、物种流行率及多界微生物存在情况。
肿瘤微生物组与基因组特征关联分析
探究肿瘤微生物载量和组成与解剖部位、基因组亚型（MSS/MSI/POLE/POLD1突变）及肿瘤突变负荷的关系。
在结直肠癌中利用PERMANOVA、线性回归和残差分析，评估微生物载量与肿瘤突变负荷的相关性，并在TCGA/TCMA数据中验证；同时分析微生物组成与肿瘤部位和突变负荷的独立关联。
早发性结直肠癌微生物组分析
比较早发性（<50岁）与平均发病年龄（≥50岁）结直肠癌的微生物组成差异。
在MSS结直肠癌中，按解剖部位分层，比较早发性和平均发病年龄病例的物种相对丰度，并在TCGA/TCMA数据中验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | ZymoBIOMICS DNA提取试剂盒 | Zymo Research | D4300 |
| DNeasy血液与组织DNA提取试剂盒 | QIAGEN | 69504 | |
| DNA定量 | Qubit双链DNA定量检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 |
| 微生物DNA标准品 | ZymoBIOMICS肠道微生物标准品 | Zymo Research | D6331 |
| 细胞培养 | HCT116细胞 | ATCC | CCL-247 |
| McCoy's 5A培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外微生物-人DNA混合基准测试 | 微生物标准品批次（ZymoBIOMICS Cat. #D6331）、人DNA来源（HCT116细胞系）、稀释梯度（1:1至1:10^8）、重复数（每个条件三个重复）、测序深度（约30X人源覆盖） 阅读提示：STAR Methods中“In vitro microbe-human DNA mixtures”小节及Figure 1E-J |
| PathSeq-T2T宿主过滤与分类 | 宿主参考基因组（T2T-CHM13）、k-mer过滤数据库（GRCh38、MHC、UniVec、Gencode、GenBank断点序列）、分类工具版本及参数（Kraken2置信度0.15，MetaPhlAn4 read_min_len 60，Sylph默认）、数据库版本（PlusPF 2024-06-05等） 阅读提示：STAR Methods中“Host filtering and microbial classification with PathSeq-T2T”小节及Figure S1A |
| 100kGP队列分析 | 样本纳入标准（新鲜冷冻、PCR-free、原发或复发实体瘤、样本量≥50）、去污染PCE阈值（0.7）、背景阈值（0.1 RPM）、微生物丰度归一化方式（RPM基于原始BAM的flagstat计数） 阅读提示：STAR Methods中“Detection of microbial signals in 100,000 Genomes Project (100kGP) cohort”和“Decontamination of 100kGP tumor microbiomes”小节及Figure 2I、Figure 3A-C |
| 肿瘤突变负荷与微生物载量关联分析 | 突变负荷计算方式（log10 mutations per megabase，基于Cornish et al.79提供的数据）、微生物载量计算（去污染后物种RPM之和）、回归模型协变量（解剖部位、基因组亚型）、TMB-high/low截断值（log10TMB > 1.25为高） 阅读提示：STAR Methods中“Regression analyses of tumor mutation burden and microbial load”和“Bivariate analysis of CRC tumor site and tumor mutation burden”小节及Figure 5E-H |
| 早发性结直肠癌微生物组分析 | 早发性定义（<50岁）、平均发病年龄定义（≥50岁）、仅限MSS癌症、按近端/远端分层、统计检验方法（Wilcoxon秩和检验） 阅读提示：STAR Methods中“Analysis of microbial composition and early-onset CRC”小节及Figure S5K-N |