患者耐药改变鉴定
识别daraxonrasib治疗后的获得性耐药改变
对40例KRAS突变癌症患者配对基线和治疗结束cfDNA/组织样本进行NGS，鉴定RAS通路相关获得性改变
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
分子胶复合物破坏驱动RAS抑制剂耐药
Disrupted molecular glue complex drives RAS inhibitor resistance.
实验完整度
高含40例患者配对样本NGS、CRISPR碱基编辑筛选、细胞系耐药模型、晶体结构、生化重组及小鼠移植瘤验证
主要模型
KRAS突变NSCLC、CRC、黑色素瘤等患者配对cfDNA/组织样本（40例） KRAS G12V突变H727肺癌细胞及SW620结直肠癌细胞 daraxonrasib长期选择获得的耐药细胞系 BRAF D594A可诱导表达的小鼠KRAS突变移植瘤模型
重点核对
患者配对基线与治疗结束cfDNA/组织样本，40例，NGS检测获得性改变 碱基编辑筛选：H727 KRAS G12V细胞，daraxonrasib vs DMSO处理21天，生物学三重复，FDR<0.05 生化重组：GNP负载KRAS 100 nM与CYPA 150 nM，加递增浓度daraxonrasib测复合物形成，n=3 细胞报告系统：split-luciferase检测KRAS-CYPA及KRAS-CRAFRBD，100 nM daraxonrasib处理2小时，n=3 小鼠移植瘤：RMC-7977单药或联合PLX-8394，BRAF D594A可诱导表达肿瘤
摘要
三复合物抑制剂（TCIs）是一类分子胶，可结合RAS的活性三磷酸鸟苷（GTP）结合状态并招募亲环蛋白A（CYPA）形成合成复合物，从而阻断致癌信号。尽管这些药物在RAS突变癌症中已显示临床活性，但耐药机制仍不明确。在此，我们分析了40例接受RAS抑制剂daraxonrasib治疗患者的配对基线和治疗结束样本，并在18例中发现了复发性改变。结构和功能分析显示，获得性突变通过破坏daraxonrasib与RAS结合所必需的相互作用（包括RAS Y64突变）或通过增强RAS-RAF相互作用（包括RAS Y71或激酶失活/低活性BRAF突变）从而有利于天然RAS-RAF信号传导，来赋予耐药性。随后，我们鉴定了一种靶向RAS Y64突变体的TCI，以及针对激酶失活BRAF驱动耐药的联合疗法。这些发现揭示了削弱分子胶功能的汇聚性耐药机制，并为提高RAS驱动恶性肿瘤的疗效提供了机制蓝图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAS(ON)三复合物抑制剂daraxonrasib在RAS突变癌症患者中的获得性耐药机制是什么，以及如何克服耐药。
- 核心机制
- 耐药改变汇聚于破坏分子胶功能：KRAS Y64突变削弱与daraxonrasib的π-π堆叠而降低三元复合物形成；KRAS Y71H通过新形态接触增强RAF RBD亲和力；低活性/激酶失活BRAF突变通过增强RAF二聚化使CRD重新定位、增强RAS结合，从而更难被CYPA置换。
- 主要证据
- 40例患者配对样本NGS发现18例获得性改变；CRISPR碱基编辑筛选和耐药细胞系验证KRAS Y64/Y71、CYPA及BRAF突变；生化重组、split-luciferase细胞报告、晶体结构（KRAS Y71H:CRAF RBD 1.76 Å）和免疫印迹验证机制；RMC-4791靶向Y64突变体，PLX-8394联合RMC-7977在移植瘤中克服BRAF D594A耐药。
- 研究意义
- 揭示分子胶疗法中天然蛋白-蛋白相互作用竞争可削弱合成复合物形成的脆弱性，为优化药物设计和合理联合治疗RAS驱动恶性肿瘤提供机制蓝图。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
碱基编辑筛选耐药位点
系统鉴定KRAS和PPIA（CYPA）中赋予daraxonrasib耐药的单核苷酸替换
在H727 KRAS G12V细胞中利用胞嘧啶碱基编辑器筛选KRAS和PPIA全编码区及剪接位点的NGN-PAM sgRNA文库，daraxonrasib或DMSO处理21天，比较sgRNA富集
耐药细胞系模型建立
通过长期药物选择获得耐药模型并验证筛选结果
KRAS突变细胞系在递增浓度daraxonrasib或RMC-7977中长期培养，传代至约80%汇合，4-20个月，鉴定耐药克隆中的KRAS Y64X、Y71H、CYPA N149D及BRAF G466A突变
KRAS Y64突变机制验证
验证Y64突变是否直接干扰KRAS-daraxonrasib-CYPA三元复合物形成
GNP负载重组KRAS与CYPA在递增daraxonrasib浓度下反应测复合物形成；HTRF测CRAFRBD置换；split-luciferase活细胞报告检测KRAS-CYPA和KRAS-CRAFRBD；免疫印迹检测ERK磷酸化；碱基编辑内源KRAS Y64突变测增殖
KRAS Y71H机制及结构解析
阐明Y71H增强RAF RBD亲和力从而竞争性阻碍CYPA招募的机制
生化复合物形成和RBD置换实验、活细胞split-luciferase报告、免疫印迹检测ERK、解析KRAS Y71H与CRAF RBD复合物1.76 Å晶体结构、R67A突变验证
CYPA变异验证
验证碱基编辑筛选鉴定的CYPA界面突变对三元复合物的影响
选择H54R、F112L、W121R、N149D四个daraxonrasib结合界面CYPA变异，用split-luciferase检测KRAS-CYPA复合物，并在H727细胞中单独碱基编辑后测daraxonrasib IC50
低活性BRAF突变耐药验证
确定激酶失活/低活性III类BRAF突变是否驱动耐药及其对分子胶功能的影响
在H727和SW620细胞中用Dox诱导表达WT或激酶失活BRAF，检测daraxonrasib对ERK信号和增殖的抑制；split-luciferase检测KRAS-BRAF相互作用和KRAS-CYPA复合物；引入R509H（破坏二聚化）或R188L（破坏RAS-RAF结合）验证依赖性
RAF二聚化与CRD机制验证
验证RAF二聚化通过CRD增强RAS结合从而使RAF更难被置换
化学配体诱导二聚化系统（DmrA/DmrC与A/C配体）诱导BRAF:CRAF、BRAF:BRAF、CRAF:CRAF二聚体，检测daraxonrasib对KRAS-RAF置换、KRAS-CYPA复合物、ERK信号和增殖的影响；CRD 3X/4X突变验证；纯化CRAF RBD-CRD-DmrB嵌合蛋白进行生化验证
RMC-4791靶向Y64突变体验证
验证RMC-4791能否克服Y64突变驱动的耐药
解析KRAS-GNP:RMC-4791:CYPA三元复合物1.57 Å晶体结构；HTRF测CRAFRBD置换；活细胞split-luciferase检测KRAS-CYPA和KRAS-CRAFRBD；免疫印迹检测ERK；结晶紫染色测增殖
联合治疗克服BRAF耐药
验证RAF二聚体破坏剂或下游抑制剂联合daraxonrasib可克服激酶失活BRAF驱动的耐药
在Dox诱导表达BRAF D594A的KRAS G12V H727细胞中测试PLX-8394、trametinib或SCH-772984联合daraxonrasib对ERK磷酸化和增殖的影响；小鼠移植瘤中测试RMC-7977单药或联合PLX-8394
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | daraxonrasib | Revolution Medicines | -- |
| RMC-7977 | Revolution Medicines | -- | |
| RMC-4791 | Revolution Medicines | -- | |
| RMC-6291 | MedChemExpress | HY-153346 | |
| RMC-9805 | Selleck Chemicals | E1962 | |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D5207 | |
| Western blot | Raf-B抗体（H-145） | Santa Cruz Biotechnology | sc-9002 |
| CyPA抗体（6-YD13） | Santa Cruz Biotechnology | sc-134310 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| p44/42 MAPK（Erk1/2）（L34F12）小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| MEK1/2（L38C12）小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4694 | |
| 磷酸化MEK1/2（Ser217/221）（41G9）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| β-肌动蛋白（13E5）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗KRAS抗体 | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | |
| 抗c-Raf抗体 | BD Bioscience | 610152 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| 活细胞报告检测 | Nano-Glo活细胞检测系统 | Promega | N2012 |
| NanoBiT蛋白互作起始系统 | Promega | N2014 | |
| Nano-Glo Endurazine活细胞底物 | Promega | N2571 | |
| KRAS活化检测 | 活性Ras拉下与检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 16117 |
| 分子克隆 | pENTR/D-TOPO克隆试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K240020 |
| Gateway LR Clonase II酶混合物 | Thermo Fisher Scientific | 11791020 | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 定点突变 | QuikChange II XL定点突变试剂盒 | Agilent | 200522 |
| 分子克隆 | NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒 | New England Biolabs | E5520S |
| 诱导二聚化 | iDimerize诱导型异二聚化系统 | Takara Bio | 635067 |
| 细胞培养 | NCI-H727细胞 | ATCC | CRL-5815 |
| SW620细胞 | ATCC | CCL-227 | |
| NCI-H358细胞 | ATCC | CRL-5807 | |
| AsPC-1细胞 | ATCC | CRL-1682 | |
| LS180细胞 | ATCC | CL-187 | |
| GP2d细胞 | Sigma-Aldrich | 95090714-1VL | |
| LoVo细胞 | ATCC | CCL-229 | |
| 293T细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Polybrene | Millipore | -- | |
| 蛋白提取 | Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78446 |
| Western blot | NuPAGE Bis-Tris中型蛋白胶 | Thermo Fisher Scientific | WG1402BX10 |
| 细胞培养 | jetOPTIMUS DNA转染试剂 | Sartorius | 101000006 |
| 质粒构建 | pInducer20-Blast载体 | Addgene | 109334 |
| pLIX_403载体 | Addgene | 41395 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 活细胞报告检测 | pBiT1.1-N[TK/LgBiT]载体 | Promega | N2014 |
| pBiT2.1-N[TK/SmBiT]载体 | Promega | N2014 | |
| 测序 | High Pure PCR模板制备试剂盒 | Roche | 11796828001 |
| SPRIselect磁珠纯化试剂 | Beckman Coulter | B23317 | |
| AlphaScreen | AlphaScreen抗6His供体磁珠 | Revvity | AS116M |
| 抗GST偶联AlphaScreen受体磁珠 | Revvity | 6760603M | |
| HTRF | 抗6His Gold单克隆抗体铕偶联物 | Revvity | 61HI2KLA |
| 抗GST单克隆抗体XL665偶联物 | Revvity | 61GSTXLA | |
| 细胞培养 | NEB Stable感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | C3040H |
| NEB 5-alpha感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | C2987H |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本耐药改变检测 | 样本类型（cfDNA或组织）、配对基线与治疗结束时间点、NGS panel（MSK-ACCESS/MSK-IMPACT/GuardantINFINITY）、治疗突变定义（仅治疗后检出） 阅读提示：STAR Methods中Patient specimens小节及Figure 1图注、Table S2 |
| 碱基编辑筛选 | 细胞模型H727 KRAS G12V、碱基编辑器nCas9(SpG)-evoCDA1-BE4max、筛选时长21天、daraxonrasib浓度、生物学三重复、覆盖度≥500X、FDR阈值0.05 阅读提示：STAR Methods中Cytosine base editor screen小节及Figure 2图注 |
| 耐药细胞系建立 | 药物浓度范围10–300 nM、选择周期4-20个月、传代汇合度约80%、耐药细胞系维持药物浓度 阅读提示：STAR Methods中Resistant models from cell culture小节及Figure S1 |
| 生化三元复合物与RBD置换 | GNP负载KRAS浓度100 nM、CYPA浓度150 nM、HTRF中GST-KRAS 10 nM与His-RBD 30 nM、daraxonrasib递增浓度、n=3 阅读提示：STAR Methods中Alpha-screen complex formation assay和HTRF RBD displacement assay小节及Figure 3图注 |
| 活细胞split-luciferase报告 | 293T细胞每孔2×10^4、LgBiT与SmBiT各50 ng、daraxonrasib处理2小时、n=3 阅读提示：STAR Methods中Live cell split-luciferase assay小节及Figure 3、4、5、6、7图注 |
| 化学配体诱导RAF二聚化 | A/C配体浓度100 nM、Dox预处理浓度（含10 ng/ml条件）、DmrA/DmrC融合于RAF C端、二聚化诱导过夜 阅读提示：STAR Methods中Chemical ligand induced RAF dimerization小节及Figure 6、S5图注 |
| BRAF可诱导表达耐药验证 | Dox诱导启动子、daraxonrasib处理2小时（ERK）或72小时（活力）、BRAF D594A/R509H/R188L突变、细胞系H727与SW620 阅读提示：STAR Methods中Stable cell line generation和Cell viability and cell proliferation assay小节及Figure 5、S2、S3图注 |
| 小鼠移植瘤联合治疗 | RMC-7977给药方案、PLX-8394剂量与给药方式、肿瘤模型BRAF D594A或D594A/R509H Dox诱导、样本量、耐受性评价 阅读提示：Figure S7C–S7E图注及STAR Methods中相关动物实验描述（文中未明确说明具体剂量与给药方案） |
| 晶体结构解析 | KRAS Y71H:CRAF RBD复合物1.76 Å、KRAS-GNP:RMC-4791:CYPA复合物1.57 Å、PDB登录号9YGS与9YOW、结晶条件 阅读提示：STAR Methods中Crystallography小节及Table S1、Figure 4D、7B图注 |