建立全身性激活与远端肢体再生加速模型
验证截肢诱导的全身性激活能否使远端未损伤肢体在未来损伤时更快再生。
对美西螈进行初次截肢诱导全身性激活，随后在远端肢体进行第二次截肢，比较再生速度、blastema面积、Prrx1表达和趾分化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肾上腺素能信号协调美西螈截肢后的远端与局部响应
Adrenergic signaling coordinates distant and local responses to amputation in axolotl.
实验完整度
高含体内截肢/去神经/药物处理、体外AL-1细胞、单细胞RNA-seq和ATAC-seq等多层证据及功能验证
主要模型
美西螈（Ambystoma mexicanum）幼体肢体截肢模型 虎纹钝口螈（Ambystoma tigrinum）自然池观察 AL-1美西螈肢体成纤维细胞系
重点核对
截肢平面：肢体中部（mid-stylopod）并修剪骨组织 去神经手术：臂丛神经或坐骨神经切断，对照为假手术 6-OHDA腹腔注射剂量300 mg/kg连续2天，恢复5天后截肢 yohimbine 1 mg/kg/天腹腔注射14天；clonidine水体30 μM；propranolol水体5 μM rapamycin水体1 μM 16天加腹腔注射5 mg/kg/天16天，截肢前2天开始；EdU 400 μM 20 μL/g腹腔注射，取材前18小时
摘要
许多物种在截肢后能再生失去的身体部位。大多数肢体再生研究关注直接损伤部位。与此同时，全身性损伤响应在很大程度上尚未被探索，但可能对再生至关重要。本文中，我们发现交感神经系统在刺激美西螈截肢后全身性干细胞激活响应中发挥作用，该响应驱动增强的肢体再生。这一响应由肾上腺素能信号介导，通过α2A-肾上腺素能受体协调远距离细胞激活响应，通过β-肾上腺素能受体协调局部再生响应。α2A-和β-肾上腺素能信号均作用于mTOR信号上游。值得注意的是，全身性激活的美西螈比 naïve 动物更快地再生肢体，提示在同类相食或捕食造成损伤常见的环境中具有潜在的选择优势。这项工作挑战了再生所依赖的细胞响应局限于损伤部位的主流观点，并主张全身性细胞 priming 作为使局部组织再生长成为可能的基础步骤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 美西螈截肢后远距离细胞如何被提示发生全身性激活，该响应与mTOR信号的关系及其对肢体再生的影响是什么。
- 核心机制
- 交感神经释放去甲肾上腺素，通过远端组织的α2A-肾上腺素能受体和损伤部位的β-肾上腺素能受体，均上游调控mTOR信号，分别驱动全身性激活和局部再生响应。
- 主要证据
- 在美西螈中通过去神经、6-OHDA交感神经消融、yohimbine/clonidine/propranolol/rapamycin药理学处理，结合EdU增殖检测、pS6免疫荧光、blastema面积和趾分化计数，以及AL-1细胞体外肾上腺素处理验证肾上腺素能信号上游调控mTOR。
- 研究意义
- 挑战再生细胞响应局限于损伤部位的主流观点，提出全身性细胞 priming 是使局部组织再生长的基础步骤，并提示在捕食或同类相食造成反复损伤的环境中具有潜在选择优势。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外周神经支配对全身性激活的必要性
检验截肢部位和远端响应部位的外周神经支配是否均为全身性激活所必需。
通过臂丛神经或坐骨神经切断术对远端肢体或截肢肢体去神经，设假手术对照，截肢后检测对侧肢体EdU+细胞。
交感神经消融对全身性激活和局部再生的影响
确定交感神经支配是否参与全身性激活和局部肢体再生。
腹腔注射6-OHDA消融交感神经末梢，TH染色验证消融效果，截肢后检测对侧肢体EdU+细胞、blastema面积和增殖细胞。
α2A和β肾上腺素能受体在全身性与局部响应中的药理学解析
区分α2A和β肾上腺素能信号在全身性激活与局部再生中的不同作用。
使用yohimbine（ADRA2A拮抗剂）、clonidine（α2A激动剂）、propranolol（非选择性β拮抗剂）处理美西螈，截肢后检测EdU+细胞、blastema面积和趾分化。
mTOR信号在全身性激活和priming中的必要性
检验mTOR信号是否参与全身性激活和远端priming。
使用rapamycin抑制mTOR，截肢后检测再生速度、blastema增殖、pS6和全身性激活，并在禁食动物中验证。
肾上腺素能信号与mTOR的上下游关系
确定肾上腺素能信号是否上游调控mTOR信号。
使用yohimbine或propranolol处理并截肢，检测对侧肢体和残肢pS6；体外用肾上腺素处理AL-1细胞检测pS6。
全身性激活细胞的转录组和染色质可及性特征
鉴定全身性激活细胞的类型、肾上腺素能受体表达及其与blastema细胞的分子相似性。
基于4C/2C核内容进行FACS分选，对稳态和全身性激活肢体的细胞进行单细胞RNA-seq和bulk ATAC-seq，分析Adra2a表达、blastema基因共表达和转录因子结合motif。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 6-羟基多巴胺 | Sigma-Aldrich | H4381 |
| 育亨宾 | Sigma-Aldrich | Y3125 | |
| 可乐定 | Sigma-Aldrich | C7897 | |
| 普萘洛尔 | Sigma-Aldrich | P0884 | |
| 雷帕霉素 | LC Laboratories | R-5000 | |
| EdU掺入实验 | 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 | Thermo Fisher Scientific | E10187 |
| 免疫荧光 | 兔抗磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 |
| 兔抗酪氨酸羟化酶抗体 | Invitrogen | PA5–85167 | |
| Cy3-山羊抗小鼠 | Jackson ImmunoResearch | 115–165-146 | |
| Alexa Fluor 488-山羊抗兔 | Jackson ImmunoResearch | 111–545-003 | |
| Cy3-山羊抗兔 | Jackson ImmunoResearch | 111–165-003 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 细胞分选 | Liberase TM研究级 | Sigma-Aldrich | 5401119001 |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| 钙黄绿素AM | Invitrogen | C3099 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P3566 | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Diagenode | C01070012 |
| RNAscope | RNAscope靶标修复试剂 | ACD | 322000 |
| 蛋白酶plus | ACD | 322331 | |
| RNAscope多重荧光检测试剂盒 | ACD | 323110 | |
| 样品包埋 | Tissue-Tek O.C.T.包埋剂 | Sakura | -- |
| 整体透明 | Histodenz | Sigma-Aldrich | D2158 |
| 细胞培养 | L-15培养基 | Sigma Aldrich | L5520 |
| 胎牛血清 | VWR | 1500–500 | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo | 15–140–122 | |
| 两性霉素B | Thermo | 15240062 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo | 25–030–081 | |
| ATAC-seq | DNA Clean and Concentrator-5试剂盒 | Zymo Research | D4014 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 美西螈品系（白化）、年龄5–7个月、体长8–11 cm、18°C、14h光/10h暗、单独饲养、随机分配 阅读提示：STAR Methods中Animals小节 |
| 去神经手术 | 臂丛神经或坐骨神经切断；假手术仅切开皮肤不切神经；术后恢复于0.5% sulfamerazine 阅读提示：STAR Methods中Denervations and amputations小节及Figure 2、Figure S1 |
| 药物处理剂量与时间 | 6-OHDA 300 mg/kg连续2天；yohimbine 1 mg/kg/天14天；clonidine 30 μM水体；propranolol 5 μM水体；rapamycin 1 μM水体16天加5 mg/kg/天腹腔注射16天，截肢前2天开始 阅读提示：STAR Methods中Drug treatments and EdU incorporation小节 |
| EdU掺入与检测 | EdU 400 μM、20 μL/g腹腔注射，取材前18小时；sulfo-cyanine 3 azide检测 阅读提示：STAR Methods中Drug treatments and EdU incorporation及Immunofluorescence小节 |
| 单细胞RNA-seq与ATAC-seq | 每个生物学重复混合12–16个肢体；截肢后14天取材；4C/2C分选；Illumina NovaSeq 6000；ATAC-seq使用10,000个4C细胞 阅读提示：STAR Methods中Cell dissociation, FACS isolation, and single-cell RNA-sequencing及ATAC-seq Library Prep小节 |
| 再生评估时间点 | blastema面积检测于7 dpa、14 dpa；趾轮廓计数于23 dpa、25 dpa、27 dpa、32 dpa、33 dpa；pS6检测于7 dpa、12 dpa；全身性激活检测于14 dpa 阅读提示：各Figure legends（Figure 1–5） |