人PDAC原发肿瘤的空间转录组分析
在单细胞分辨率下绘制重复RNA和编码RNA在PDAC肿瘤细胞及微环境中的空间分布。
使用NanoString CosMx SMI平台，结合1000-plex RNA panel和定制重复RNA探针（LINE-1 ORF1/ORF2、HSATII、HERV-K、HERV-H），对46例PDAC FFPE和TMA样本进行成像，经Insitutype算法进行细胞分型。
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重复RNA破坏人胰腺癌细胞的可塑性
Disruption of cellular plasticity by repeat RNAs in human pancreatic cancer.
实验完整度
高含46例患者肿瘤空间转录组、细胞系体外功能验证、EV传递实验及IRF3机制验证
主要模型
46例人PDAC原发肿瘤FFPE组织及TMA 患者来源PDAC细胞系（PDAC3、PDAC6等） 患者来源CAF细胞系（CAF-1、CAF-2、CAF-3） 细胞外囊泡（PDAC及CAF来源）
重点核对
CosMx SMI使用1000-plex RNA panel加定制重复RNA探针，分析46例PDAC、418,224个细胞、161个FOV EV处理浓度1×10^9 ml^-1，处理PDAC和CAF细胞后检测IFNB1和ISG表达 HSATII IVT RNA转染剂量31.25 fmol（低）和250 fmol（高），处理48小时 anti-CD9抗体5 μg ml^-1预处理EV 2小时以阻断摄取 RNA-ISH分析163例患者样本（未治疗或FOLFIRINOX化疗后）的HSATII与EMT标志物
摘要
胰腺导管腺癌（PDAC）中重复RNA的异常表达模拟病毒样应答，对肿瘤细胞状态及周围微环境产生影响。为更好地理解重复RNA在人PDAC中的关系，我们对46例原发肿瘤进行了单细胞分辨率的空间分子成像，揭示高重复RNA表达与PDAC细胞上皮状态改变及癌症相关成纤维细胞（CAF）中肌成纤维细胞表型改变的相关性。在PDAC和CAF细胞培养模型中给予细胞外囊泡（EV）和单个重复RNA后，观察到这种细胞身份丧失，提示这些病毒样元件的细胞间通讯。PDAC和CAF应答差异通过干扰素调节转录因子3（IRF3）介导的独特先天免疫信号驱动。重复RNA的细胞背景特异性病毒样应答为PDAC微环境中多种细胞类型的细胞可塑性调节提供了机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 重复RNA在人PDAC细胞和肿瘤微环境中如何空间分布，是否以及如何通过细胞间通讯影响PDAC细胞和CAF的细胞状态与可塑性。
- 核心机制
- PDAC来源的细胞外囊泡将重复RNA传递给CAF和PDAC细胞；重复RNA通过IRF3依赖的先天免疫信号在PDAC和CAF中产生分歧性应答，PDAC中IRF3持续激活诱导EMT，CAF中IRF3减少导致myCAF向iCAF转变。
- 主要证据
- 46例PDAC空间转录组显示重复RNA与上皮/肌成纤维细胞基因表达改变相关；PDAC和CAF细胞系中EV及IVT重复RNA处理诱导IFNB1/ISG并改变细胞状态；IRF3敲低或过表达及CRISPR敲除验证IRF3依赖性；患者TMA免疫荧光显示PDAC肿瘤细胞IRF3阳性比例高于CAF。
- 研究意义
- 揭示了重复RNA作为内源性病毒样元件通过EV在PDAC微环境中传递并调节多种细胞可塑性的机制，为理解肿瘤异质性和基质细胞状态转变提供了新维度。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重复RNA高表达细胞状态的差异基因表达与空间邻近分析
分析重复RNA高表达与细胞状态基因表达改变的关系，以及CAF与PDAC细胞的空间邻近效应。
将癌症细胞按LINE-1 ORF1高/低分组进行差异表达分析；对CAF、巨噬细胞和内皮细胞进行同样分析；使用Poisson回归模型分析CAF基因表达与不同半径内PDAC细胞数量的关系。
公共scRNA-seq数据验证CAF过渡状态
利用独立数据集验证重复RNA相关非编码RNA标志CAF从myCAF向iCAF的过渡状态。
分析GSE253559中患者来源胰腺癌类器官与CAF共培养的scRNA-seq数据，以MALAT1和NEAT1作为重复RNA替代标志物。
细胞外囊泡的分离、表征及功能处理
验证PDAC来源EV是否作为重复RNA递送载体并诱导PDAC和CAF的干扰素应答及细胞状态改变。
从PDAC3、PDAC6和CAF-1培养上清中通过尺寸排阻色谱分离EV，经NTA、TEM和免疫印迹表征；用EV处理PDAC、CAF、THP-1和HUVEC细胞，检测IFNB1、ISG及细胞状态基因；用anti-CD9抗体阻断EV摄取。
IVT重复RNA转染及CAF功能实验
验证单个重复RNA种类是否足以诱导CAF干扰素应答、myCAF向iCAF转变及功能丧失。
体外转录HSATII、HERV-K (env)、LINE-1 5'UTR和3'UTR，以ACTB和GFP为对照，转染CAF和PDAC细胞；检测IFNB1、ISG和细胞状态基因；进行迁移实验和胶原凝胶收缩实验；收集条件培养基处理PDAC细胞。
重复RNA诱导PDAC EMT及患者样本RNA-ISH验证
验证重复RNA是否诱导PDAC细胞EMT，并在人原发肿瘤中分析HSATII与EMT异质性的相关性。
在PDAC3、PDAC6等细胞系中转染IVT重复RNA，检测间质和上皮标志物及迁移能力；对163例患者样本进行多重RNA-ISH检测HSATII和Epi/QM标志物，用Halo软件定量。
IRF3依赖的先天免疫信号机制验证
确定PDAC和CAF对重复RNA分歧性应答是否依赖TBK1-IRF3信号通路。
HSATII转染后免疫印迹检测p-TBK1、IRF3、NF-κB通路及凋亡标志物；核质分离检测IRF3定位；siRNA或CRISPR敲低TBK1、IRF3；IRF3过表达；患者TMA多重免疫荧光检测PanCK、α-SMA和IRF3。
重复RNA感知受体鉴定
鉴定PDAC和CAF细胞中介导重复RNA应答的上游核酸感知受体。
在PDAC细胞中CRISPR敲除DDX58(RIG-I)、IFIH1(MDA5)、MAVS，检测p-TBK1和IFNB1/EMT基因；在CAF-1中敲除MAVS并检测NF-κB和IFNB1；检测TLR表达；用AF488标记HSATII ssRNA检测dsRNA共定位；敲低SAMHD1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组 | NanoString CosMx空间分子成像仪 | NanoString | -- |
| 粘性SecureSeal杂交腔 | Grace Bio-Labs | -- | |
| SUPERase•In RNA酶抑制剂 | ThermoFisher | -- | |
| EV分离 | 70 nm qEV柱 | Izon Science | -- |
| Amicon Ultra-15离心过滤单元 | EMD Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Amicon Ultra-2离心过滤单元 | EMD Millipore Sigma | UFC201024 | |
| EV表征 | Nanosight LM10纳米颗粒追踪分析仪 | Malvern Panalytical | -- |
| JEOL JEM 1011透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| EV摄取阻断 | PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT |
| 抗CD9抗体 | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| IVT RNA合成 | MAXIscript SP6转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1308 |
| MAXIscript T7转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1312 | |
| Megaclear转录纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| IVT RNA荧光标记 | ChromaTide Alexa Fluor 488-5-UTP | Invitrogen | C11403 |
| IVT RNA去磷酸化 | 南极磷酸酶 | New England Biolabs | M0289S |
| RNA转染 | Jetmessenger mRNA转染试剂 | Polyplus-transfection | 101000005 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CleanCap EGFP mRNA | TriLink Biotechnologies | L-7601-100 | |
| RT-qPCR | miRNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 217004 |
| TaqMan逆转录试剂 | Invitrogen | N8080234 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | |
| Western blot | Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | ThermoFisher Scientific | 78440 |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34577 | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | 34094 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 免疫荧光 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| 抗dsRNA抗体（克隆rJ2） | Sigma-Aldrich | MABE1134 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21135 | |
| ELISA | 人IFN-β Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DIFNB0 |
| 核质分离 | 核质分离试剂盒 | BioVision Inc | K266-25 |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| RPMI1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 10565018 | |
| IMDM培养基 | Gibco | 12440-053 | |
| EGM-2内皮细胞生长培养基-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437028 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| B-27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 表皮生长因子 | Invitrogen | PHG0311 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Gibco | PHG0264 | |
| 诱导表达 | 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 免疫刺激对照 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| 细胞培养 | 大鼠尾I型胶原 | Corning | 354249 |
| 支原体检测 | MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-705 |
| RNA-ISH | HSATII RNA-ISH探针 | ACDBio | 512018 |
| 上皮+准间质双链RNA-ISH探针 | ACDBio | 321762 | |
| 多重免疫荧光 | Opal三色抗兔检测试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL830001 KT |
| 抗α-SMA抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| 抗IRF3抗体[EPR2418Y] | Abcam | ab68481 | |
| 抗人细胞角蛋白抗体（克隆AE1/AE3） | Agilent | M3515 | |
| Western blot | 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 11904 |
| 抗磷酸化TBK1（Ser172）抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗cleaved caspase-3（Asp175）抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗γH2AX（Ser139）抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| 抗CD63抗体 | BioLegend | 353039 | |
| 抗Flotillin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3253 | |
| 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 3743 | |
| 抗MDA5抗体 | Cell Signaling Technology | 5321 | |
| 抗MAVS抗体 | Cell Signaling Technology | 3993l |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CosMx SMI空间转录组 | 样本类型和数量（46例PDAC）、切片厚度5 μm、1000-plex RNA panel加定制重复RNA探针、细胞分型算法Insitutype参数、FOV筛选标准（去除6个高自发荧光FOV、少于20个转录本的细胞剔除） 阅读提示：Methods 'CosMx SMI sample preparation and data collection'、'CosMx data pre-processing'及'Cell typing'小节，Figure 1 legend |
| EV分离与处理 | EV分离方法（70 nm qEV尺寸排阻色谱）、EV处理浓度1×10^9 ml^-1、EV表征方法（NTA、TEM、CD9/CD63/Flotillin-1免疫印迹）、anti-CD9阻断浓度5 μg ml^-1及预处理时间2小时 阅读提示：Methods 'Extracellular vesicles (EVs) isolation and characterization'小节，Figure 3 legend及Figure S3 |
| IVT重复RNA转染 | IVT RNA种类（HSATII、HERV-K env、LINE-1 5'UTR/3'UTR）、转染试剂Jetmessenger、转染剂量31.25 fmol和250 fmol、处理时间48小时、对照GFP mRNA和ACTB IVT RNA 阅读提示：Methods 'In-vitro transcribed (IVT) RNA synthesis'小节，Figure 4 legend及Figure S4 |
| 患者样本RNA-ISH | 患者样本数量（163例：未治疗137例，FOLFIRINOX化疗后26例）、HSATII探针货号512018、Epi+QM探针货号321762、HSATII低/中/高分组依据（三分位数）、QM细胞定义（上皮和间质双阳性）、统计方法（Wilcoxon秩和检验） 阅读提示：Methods 'RNA-ISH in human tissue samples and quantification'小节，Figure 5E–H legend及Figure S5E |
| IRF3机制验证 | HSATII转染剂量（31.25 fmol低、250 fmol高）、时间点（3、6、24、48小时）、siRNA靶向TBK1和IRF3、sgRNA靶向IRF3序列、核质分离试剂盒、TMA多重免疫荧光抗体稀释比（一抗1:100，Opal 780 1:25，其余Opal 1:150） 阅读提示：Methods 'Plasmids construction and siRNA'、'Subcellular fractionation'、'Multiplex immunofluorescence staining in primary PDAC patients TMA and quantification'小节，Figure 6 legend及Figure S6 |