mTOR活性调节人类囊胚阶段发育进程的速度

mTOR activity paces human blastocyst stage developmental progression.

作者信息Dhanur P Iyer, Heidar Heidari Khoei, Vera A van der Weijden, Harunobu Kagawa, Saurabh J Pradhan, Maria Novatchkova, Afshan McCarthy, Teresa Rayon, Claire S Simon, Ilona Dunkel, Sissy E Wamaitha, Kay Elder, Phil Snell, Leila Christie, Edda G Schulz, Kathy K Niakan, Nicolas Rivron, Aydan Bulut-Karslioğlu
PMID39332412
期刊Cell
发布时间2024-11-14
DOI10.1016/j.cell.2024.08.048

实验完整度

高

包含人类多能干细胞、类囊胚及小鼠囊胚多体系,覆盖功能、分子与体内样验证

主要模型

naive人类多能干细胞(PXGL培养) 人类类囊胚(blastoids) 小鼠囊胚及小鼠胚胎干细胞

重点核对

mTORi处理浓度:RapaLink-1 100/200/300 nM或INK128 200 nM mTORi处理时间窗口:类囊胚形成第2天至第4/5天或完全扩张后(第4天)开始 mTORi处理下类囊胚形态维持及TE/ICM细胞数变化 mTORi处理类囊胚对激素刺激子宫内膜细胞的黏附率 撤除mTORi后类囊胚的再激活及分化能力

摘要

Many mammals can temporally uncouple conception from parturition by pacing down their development around the blastocyst stage. In mice, this dormant state is achieved by decreasing the activity of the growth-regulating mTOR signaling pathway. It is unknown whether this ability is conserved in mammals in general and in humans in particular. Here, we show that decreasing the activity of the mTOR signaling pathway induces human pluripotent stem cells (hPSCs) and blastoids to enter a dormant state with limited proliferation, developmental progression, and capacity to attach to endometrial cells. These in vitro assays show that, similar to other species, the ability to enter dormancy is active in human cells around the blastocyst stage and is reversible at both functional and molecular levels. The pacing of human blastocyst development has potential implications for reproductive therapies.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
人类细胞在囊胚阶段是否具有进入可逆休眠状态的能力,以及mTOR通路是否调节该过程。
核心机制
降低mTOR信号通路活性可诱导人类多能干细胞和类囊胚进入休眠样状态,表现为增殖受限、发育进程减慢及黏附能力下降,且该状态在功能与分子水平可逆。
主要证据
人类类囊胚和小鼠囊胚中pS6模式保守;mTORi处理类囊胚后TE样细胞减少、CCR7和NR2F2表达降低、黏附率下降;scRNA-seq显示类囊胚转录组主要停留在囊胚阶段;撤除mTORi后类囊胚可再激活并分化。
研究意义
提示mTOR活性可调节人类囊胚发育和植入的时间窗口,对生殖治疗技术及理解人类早期胚胎发育具有潜在意义。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

比较小鼠与人类囊胚mTOR通路活性模式

探究小鼠与人类囊胚中mTOR通路活性模式是否相似。

对人类和小鼠囊胚进行pS6等免疫荧光染色,比较mTOR下游靶标在TE和ICM中的分布;并用IGF1处理人类和小鼠胚胎,检测囊胚形成率及ICM细胞数。

2

抑制mTOR对类囊胚TE发育和黏附的影响

验证mTOR活性是否调节TE发育及类囊胚与子宫内膜细胞的黏附能力。

在类囊胚形成第2天至第4/5天使用RapaLink-1抑制mTOR,检测类囊胚形态、TE样细胞数量、CCR7和NR2F2表达,并将类囊胚转移到子宫内膜细胞层检测黏附能力。

3

mTORi延长类囊胚的囊胚样阶段

验证mTORi是否可延缓完全形成类囊胚的发育进程。

在类囊胚完全扩张后(第4天)开始mTORi处理,纵向观察形态维持、TE和ICM增殖及谱系标志物表达,并进行蛋白质组比较。

4

比较翻译抑制与mTORi的效果

探究mTORi诱导的休眠状态是否仅由翻译抑制介导。

用cycloheximide(CHX)抑制翻译,比较CHX与mTORi处理类囊胚的形态、ICM细胞变化及蛋白质组差异。

5

单细胞转录组分析mTORi类囊胚的发育阶段

确定mTORi处理类囊胚中各谱系细胞的转录组发育阶段。

对对照和mTORi处理类囊胚进行scRNA-seq,并将数据投影到人类胚胎参考图谱。

6

验证mTORi状态在人类多能干细胞中的可逆性

探究不同多能性状态的人类PSC对mTORi的响应及撤药后的可逆性。

对naive(PXGL)、naive-primed中间态(RSeT)和primed(mTeSR)人类PSC进行mTORi处理,检测增殖、凋亡、细胞周期、多能性标志物及蛋白质组变化,并在撤药后检测恢复情况。

7

验证mTORi类囊胚再激活后的发育能力

验证mTORi处理类囊胚在撤药后能否恢复发育并产生胚后植入样结构。

将mTORi处理3天的类囊胚撤药后置于Matrigel包被板中,在CMRL-1066培养基中培养,检测EPI和滋养层分化标志物、hCG分泌、scRNA-seq及干细胞系衍生能力。

8

探索不依赖mTORi的替代休眠诱导途径

探究营养剥夺、半乳糖代谢和IGFR抑制是否可诱导人类PSC进入休眠样状态。

在naive hPSC中分别或组合使用减少营养、半乳糖补充和IGFR抑制剂,检测有丝分裂细胞比例和增殖曲线。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RapaLink-1Apexbio/BiozolAPE-A8764
INK128MedChemExpress/BiozolMCE-HY-13328
Torin1Abcamab218606
重组人IGF-I/IGF-1蛋白R and D Systems291-G1
兔抗磷酸化S6核糖体蛋白(Ser235/236)单克隆抗体Cell Signaling Technology4858
鼠抗Oct3/4(C-10)单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-5279
CD197(CCR7)单克隆抗体(3D12),PE标记Thermo Fisher Scientific12-1979-42
基质胶Corning356231
mTeSR培养基StemCell Technologies85850
RSeT培养基StemCell Technologies05975
Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式细胞术检测试剂盒Thermo Fisher ScientificC10425
Annexin V Ready Flow凋亡检测偶联物Thermo Fisher ScientificR37174
Chromium Next GEM单细胞3' LT试剂盒v3.110x GenomicsPN-1000325
timsTOF SCP质谱仪Bruker--
iST 96x样品处理试剂盒PreOmicsP.O.00027

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
mTORi处理类囊胚
RapaLink-1浓度(100/200/300 nM)、处理起始时间(第2天或完全扩张后第4天)、处理持续时间及撤药时间点
阅读提示:Methods中mTORi treatments及Blastoid generation小节;Figure 2A、Figure 3A和S2D图注
类囊胚培养与形成
naive hPSC接种密度、水凝胶微孔尺寸(300或400 μm)、培养基(PALLY/N2B27)、换液频率
阅读提示:Methods中Blastoid generation小节
子宫内膜黏附实验
子宫内膜细胞类型(OFEL或Ishikawa)、激素刺激条件(孕酮和雌激素浓度)、黏附检测时间(48小时或24小时)
阅读提示:Methods中Attachment to endometrial cells小节;Figure 2F图注
人类PSC的mTORi处理
细胞状态(naive PXGL、RSeT、primed mTeSR)、mTORi浓度(INK128 200 nM或RapaLink-1 200 nM)、处理时长及撤药方案
阅读提示:Methods中mTORi treatments小节;Figure 5A和S6A图注
类囊胚再激活培养
再激活培养基成分(CMRL-1066、10% FBS、孕酮、雌激素等)、Matrigel包被、培养时间及scRNA-seq样本收集时间点
阅读提示:Methods中Blastoid reactivation after mTORi treatment in postimplantation culture conditions小节;Figure 6A和6B图注
单细胞RNA测序分析
细胞质控阈值(基因数、线粒体RNA比例)、参考数据集整合方法、批次校正方法
阅读提示:Methods中Single-cell RNA-seq data analysis and projection on the human embryo reference map小节