比较小鼠与人类囊胚mTOR通路活性模式
探究小鼠与人类囊胚中mTOR通路活性模式是否相似。
对人类和小鼠囊胚进行pS6等免疫荧光染色,比较mTOR下游靶标在TE和ICM中的分布;并用IGF1处理人类和小鼠胚胎,检测囊胚形成率及ICM细胞数。
mTOR activity paces human blastocyst stage developmental progression.
包含人类多能干细胞、类囊胚及小鼠囊胚多体系,覆盖功能、分子与体内样验证
naive人类多能干细胞(PXGL培养) 人类类囊胚(blastoids) 小鼠囊胚及小鼠胚胎干细胞
mTORi处理浓度:RapaLink-1 100/200/300 nM或INK128 200 nM mTORi处理时间窗口:类囊胚形成第2天至第4/5天或完全扩张后(第4天)开始 mTORi处理下类囊胚形态维持及TE/ICM细胞数变化 mTORi处理类囊胚对激素刺激子宫内膜细胞的黏附率 撤除mTORi后类囊胚的再激活及分化能力
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
探究小鼠与人类囊胚中mTOR通路活性模式是否相似。
对人类和小鼠囊胚进行pS6等免疫荧光染色,比较mTOR下游靶标在TE和ICM中的分布;并用IGF1处理人类和小鼠胚胎,检测囊胚形成率及ICM细胞数。
验证mTOR活性是否调节TE发育及类囊胚与子宫内膜细胞的黏附能力。
在类囊胚形成第2天至第4/5天使用RapaLink-1抑制mTOR,检测类囊胚形态、TE样细胞数量、CCR7和NR2F2表达,并将类囊胚转移到子宫内膜细胞层检测黏附能力。
验证mTORi是否可延缓完全形成类囊胚的发育进程。
在类囊胚完全扩张后(第4天)开始mTORi处理,纵向观察形态维持、TE和ICM增殖及谱系标志物表达,并进行蛋白质组比较。
探究mTORi诱导的休眠状态是否仅由翻译抑制介导。
用cycloheximide(CHX)抑制翻译,比较CHX与mTORi处理类囊胚的形态、ICM细胞变化及蛋白质组差异。
确定mTORi处理类囊胚中各谱系细胞的转录组发育阶段。
对对照和mTORi处理类囊胚进行scRNA-seq,并将数据投影到人类胚胎参考图谱。
探究不同多能性状态的人类PSC对mTORi的响应及撤药后的可逆性。
对naive(PXGL)、naive-primed中间态(RSeT)和primed(mTeSR)人类PSC进行mTORi处理,检测增殖、凋亡、细胞周期、多能性标志物及蛋白质组变化,并在撤药后检测恢复情况。
验证mTORi处理类囊胚在撤药后能否恢复发育并产生胚后植入样结构。
将mTORi处理3天的类囊胚撤药后置于Matrigel包被板中,在CMRL-1066培养基中培养,检测EPI和滋养层分化标志物、hCG分泌、scRNA-seq及干细胞系衍生能力。
探究营养剥夺、半乳糖代谢和IGFR抑制是否可诱导人类PSC进入休眠样状态。
在naive hPSC中分别或组合使用减少营养、半乳糖补充和IGFR抑制剂,检测有丝分裂细胞比例和增殖曲线。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| mTOR抑制处理 | RapaLink-1 | Apexbio/Biozol | APE-A8764 |
| INK128 | MedChemExpress/Biozol | MCE-HY-13328 | |
| Torin1 | Abcam | ab218606 | |
| 胚胎培养 | 重组人IGF-I/IGF-1蛋白 | R and D Systems | 291-G1 |
| 免疫荧光 | 兔抗磷酸化S6核糖体蛋白(Ser235/236)单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 |
| 鼠抗Oct3/4(C-10)单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| 流式细胞术 | CD197(CCR7)单克隆抗体(3D12),PE标记 | Thermo Fisher Scientific | 12-1979-42 |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| mTeSR培养基 | StemCell Technologies | 85850 | |
| RSeT培养基 | StemCell Technologies | 05975 | |
| 细胞周期检测 | Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10425 |
| 凋亡检测 | Annexin V Ready Flow凋亡检测偶联物 | Thermo Fisher Scientific | R37174 |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞3' LT试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN-1000325 |
| 蛋白质组学 | timsTOF SCP质谱仪 | Bruker | -- |
| iST 96x样品处理试剂盒 | PreOmics | P.O.00027 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mTORi处理类囊胚 | RapaLink-1浓度(100/200/300 nM)、处理起始时间(第2天或完全扩张后第4天)、处理持续时间及撤药时间点 阅读提示:Methods中mTORi treatments及Blastoid generation小节;Figure 2A、Figure 3A和S2D图注 |
| 类囊胚培养与形成 | naive hPSC接种密度、水凝胶微孔尺寸(300或400 μm)、培养基(PALLY/N2B27)、换液频率 阅读提示:Methods中Blastoid generation小节 |
| 子宫内膜黏附实验 | 子宫内膜细胞类型(OFEL或Ishikawa)、激素刺激条件(孕酮和雌激素浓度)、黏附检测时间(48小时或24小时) 阅读提示:Methods中Attachment to endometrial cells小节;Figure 2F图注 |
| 人类PSC的mTORi处理 | 细胞状态(naive PXGL、RSeT、primed mTeSR)、mTORi浓度(INK128 200 nM或RapaLink-1 200 nM)、处理时长及撤药方案 阅读提示:Methods中mTORi treatments小节;Figure 5A和S6A图注 |
| 类囊胚再激活培养 | 再激活培养基成分(CMRL-1066、10% FBS、孕酮、雌激素等)、Matrigel包被、培养时间及scRNA-seq样本收集时间点 阅读提示:Methods中Blastoid reactivation after mTORi treatment in postimplantation culture conditions小节;Figure 6A和6B图注 |
| 单细胞RNA测序分析 | 细胞质控阈值(基因数、线粒体RNA比例)、参考数据集整合方法、批次校正方法 阅读提示:Methods中Single-cell RNA-seq data analysis and projection on the human embryo reference map小节 |