CCBC方法建立与胰腺概念验证
验证C-CRISPR联合囊胚互补（CCBC）能否一步生成器官重构嵌合体
将靶向Pdx1的4条sgRNA（100ng/μl）和Cas9 mRNA（80ng/μl）共注射到小鼠受精卵，随后将8-10个tdTomato标记的mESCs注射到囊胚中，观察胰腺重构。
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在小鼠体内生成大鼠前脑组织
Generation of rat forebrain tissues in mice.
实验完整度
高包含体外ES细胞、小鼠胚胎/嵌合体、大鼠-小鼠种间嵌合体及单细胞转录组和电生理功能验证
主要模型
小鼠ES细胞（C57BL/6） 大鼠ES细胞（Sprague-Dawley） Hesx1−/−小鼠囊胚 Dkk1−/−小鼠囊胚
重点核对
C-CRISPR介导的基因敲除效率（4细胞期胚胎PCR和Sanger测序） 前脑发育不全和重构效率（E12.5胚胎及新生儿嵌合体） 供体细胞贡献率（tdTomato+细胞比例） 前脑组织结构（Ctip2免疫染色和皮层/海马分层宽度） 行为学测试（Morris水迷宫、旷场、情境恐惧条件化）
摘要
种间囊胚互补（IBC）为研究发育提供了独特平台，并有望解决全球器官短缺问题。然而，尽管近期取得了成功，脑组织尚未通过IBC实现。在此，我们开发了一种基于C-CRISPR的优化IBC策略，该策略有助于快速筛选候选基因，并鉴定出Hesx1缺陷支持通过IBC在小鼠体内生成大鼠前脑组织。成年小鼠体内的异种大鼠前脑组织在结构和功能上是完整的。跨物种比较分析显示，大鼠前脑组织与小鼠宿主以相同速度发育，但保持大鼠样转录组谱。随着发育进展，大鼠细胞的嵌合率逐渐下降，提示在妊娠中晚期存在异种屏障。种间前脑互补为研究脑发育和认知功能背后进化保守和分化的机制打开了大门。基于C-CRISPR的IBC策略在拓宽种间器官发生的研究和应用方面具有巨大潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过种间囊胚互补在小鼠体内生成大鼠前脑组织，并明确其结构和功能特征？
- 核心机制
- Hesx1敲除在小鼠囊胚中创建前脑发育生态位，供体大鼠ESCs填充该生态位并分化为前脑组织；细胞自主机制决定神经元转录组特征，非细胞自主机制决定大小和发育时序。
- 主要证据
- 在Hesx1−/−小鼠囊胚中注射rESCs获得前脑重构嵌合体；重构的大鼠前脑组织在结构（Ctip2染色、皮层分层）、功能（电生理、轴突投射）和行为学测试中与对照无显著差异；单细胞RNA-seq显示大鼠细胞保持大鼠样转录组。
- 研究意义
- 种间前脑互补为研究脑发育和认知功能的进化保守与分化机制提供了平台，并拓展了种间器官发生的研究和应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因筛选
筛选适合用于前脑囊胚互补的候选基因
使用C-CRISPR靶向敲除7个参与Wnt信号调控的基因，检测E12.5胚胎前脑发育不全表型，并注射mESCs观察前脑重构。
种内前脑互补验证
验证Hesx1和Dkk1敲除支持小鼠-小鼠前脑囊胚互补
将tdTomato+ mESCs注射到Hesx1−/−或Dkk1−/−小鼠囊胚中，观察新生嵌合体前脑重构效率、供体细胞贡献和成年后脑结构功能。
种间前脑互补验证
验证大鼠ESCs能否在小鼠体内重构前脑组织
将tdTomato+ rESCs注射到Hesx1−/−或Dkk1−/−小鼠囊胚中，观察新生嵌合体前脑重构效率、供体细胞贡献和成年后脑结构功能。
重构前脑的结构和功能评估
评估重构的大鼠前脑组织是否结构和功能正常
通过免疫染色检测Ctip2和分层结构，电生理记录神经元电学特性，AAV追踪轴突投射，行为学测试认知功能。
单细胞转录组分析
比较嵌合体大鼠和小鼠细胞与野生型大鼠和小鼠细胞的转录组特征
对P0嵌合体、WT小鼠和WT大鼠的皮层和海马进行scRNA-seq，分析细胞类型、物种来源和差异表达基因。
异种屏障动态监测
监测大鼠细胞贡献率随发育的变化
对不同发育阶段胚胎和胎儿切片进行荧光成像，量化大鼠细胞在全身和前脑中的嵌合率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ES细胞标记 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 细胞培养 | KnockOut DMEM培养基 | Gibco | 10829-018 |
| KnockOut血清替代物 | Gibco | 10828028 | |
| CHIR99021 | Selleck | S1263 | |
| PD035901 | Selleck | S1036 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| 大鼠白血病抑制因子 | ESGRO | ESG2206 | |
| 显微注射 | FemtoJet显微注射仪 | Eppendorf | -- |
| 胚胎培养 | 含D-葡萄糖的KSOM+AA培养基 | Millipore | MR-106-D |
| 胚胎操作 | M2培养基 | Millipore | MR-015-D |
| 细胞松弛素B | Sigma | C6762 | |
| 免疫荧光 | 抗Ctip2抗体（大鼠单克隆） | Abcam | ab18465 |
| 抗RFP抗体（兔多克隆） | Rockland | 600401379 | |
| 抗α-淀粉酶抗体（兔多克隆） | Thermo Fisher Scientific | PA5-51078 | |
| 抗胰岛素抗体（兔多克隆） | Proteintech | 15848-1-AP | |
| 抗胰高血糖素抗体（兔多克隆） | Proteintech | 15954-1-AP | |
| Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗 | Jackson | 711545152 | |
| Alexa Fluor 488标记驴抗大鼠IgG二抗 | Jackson | 712545153 | |
| Cy3标记山羊抗兔IgG二抗 | Jackson | 111165003 | |
| AAV注射 | AAV8-hSyn-EGFP病毒 | -- | -- |
| 电生理记录 | Multiclamp 700B放大器 | Molecular Devices | -- |
| Digidata1550A数模转换器 | Molecular Devices | -- | |
| 行为学测试 | EthoVisonXT 11.5行为追踪系统 | Noldus | -- |
| FreezeFrame 4.07行为记录软件 | Actimetrics | -- | |
| 体外转录 | mMESSAGE mMACHINE T7体外转录试剂盒 | Life Technologies | AM1345 |
| MEGAshortscript T7体外转录试剂盒 | Life Technologies | AM1354 | |
| MEGAclear RNA纯化试剂盒 | Life Technologies | AM1908 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CCBC基因敲除 | sgRNA浓度（25ng/μl用于基因分型，100ng/μl用于Pdx1敲除）、Cas9 mRNA浓度80ng/μl、注射卵母细胞阶段（2原核期） 阅读提示：Methods: Microinjection of mRNAs into zygotes and establishment of blastocysts |
| 囊胚注射 | 每个囊胚注射的ESCs数量（8-12个）、注射位置（ICM附近） 阅读提示：Methods: Microinjection of mRNAs into zygotes and establishment of blastocysts |
| 胚胎移植 | 受体小鼠品系（ICR）、假孕诱导方式、每受体移植胚胎数（15-20个） 阅读提示：Methods: Transfer of mouse embryos |
| 前脑重构效率评估 | Hesx1−/−+rESCs嵌合体前脑重构率（部分96.16%，完全3.84%）、Dkk1−/−+rESCs嵌合体前脑重构率（100%部分） 阅读提示：Results: CCBC enables interspecies neural blastocyst complementation; Figure 3B |
| 电生理记录 | 切片厚度300μm、记录温度、电极电阻6-8MΩ、ACSF配方、电流注射方案（2s duration, 10pA step） 阅读提示：Methods: Whole-Cell Patch-Clamp Recordings |
| 行为学测试 | Morris水迷宫平台位置、水温20-23°C、训练天数5天、测试天数第6天；情境恐惧条件化电击强度0.75mA、持续时间180s 阅读提示：Methods: Morris water maze (MWM); Contextual fear conditioning |
| 单细胞RNA-seq | 细胞来源（P0皮层和海马）、物种来源判定标准（10倍计数差异）、质控标准（线粒体计数<10%）、DoubletFinder过滤 阅读提示：Methods: Analysis of single-cell RNA-seq data |