Spns2cryo构建与功能验证
验证用于冷冻电镜研究的Spns2cryo构建体具有与野生型相似的转运活性。
将MBP融合至Spns2 N端，DARPin off7融合至C端，在HEK293-SphK1细胞中表达，通过NBD-鞘氨醇输出实验和LC-MS检测S1P输出。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Spns2介导的1-磷酸鞘氨醇转运的结构与功能见解
Structural and functional insights into Spns2-mediated transport of sphingosine-1-phosphate.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、细胞功能验证、突变验证、LC-MS和分子动力学模拟等多层级证据
主要模型
HEK293-SphK1细胞系 HEK293S细胞系 Sf9昆虫细胞 Saposin纳米盘重组Spns2
重点核对
Spns2cryo与野生型Spns2的S1P输出活性比较（荧光法和LC-MS） Spns2抑制剂16d的IC50测定（约6 μM） 关键残基突变体（如Y235A、P239A、L332A、I336A、G374A、I429A、F437A、W440A、F236A、Y246A）的转运活性 不同pH（6.5、7.5、8.5）和离子条件（Na+、K+、NMDG）下的转运活性 NBD-S1P摄取实验（Spns2WT与Spns2Y246A）
摘要
1-磷酸鞘氨醇（S1P）是一种重要的信号鞘脂，调节免疫系统、血管生成、听觉功能以及上皮和内皮屏障完整性。Spinster同源物2（Spns2）是一种S1P转运蛋白，可将S1P输出以启动脂质信号级联。调节Spns2活性可能有益于癌症、炎症和免疫疾病的治疗。然而，Spns2的转运机制及其抑制仍不清楚。在此，我们展示了人类Spns2在脂质纳米盘中六个功能相关的中间构象的冷冻电镜结构，这些构象连接了内向和外向状态，揭示了S1P转运循环的结构基础。功能分析表明，Spns2通过易化扩散输出S1P，这是一种与其他MFS脂质转运蛋白不同的机制。最后，我们显示Spns2抑制剂16d通过将Spns2锁定在内向状态来减弱转运活性。我们的工作揭示了Spns2介导的S1P转运，并有助于开发先进的Spns2抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Spns2如何转运S1P，其转运机制及抑制剂16d的抑制机制是什么？
- 核心机制
- Spns2通过易化扩散（facilitated diffusion）以单向转运体（uniporter）方式转运S1P，不依赖质子或钠离子梯度；抑制剂16d占据内向腔穴并与S1P竞争，将Spns2锁定在内向构象。
- 主要证据
- 六个冷冻电镜结构（分辨率2.9-4.2 Å）揭示了S1P结合的内向和外向状态及两个中间构象；细胞功能实验表明Spns2可双向转运S1P且不依赖pH或Na+；突变分析验证了关键残基；LC-MS检测到内源性S1P；16d结合结构显示其锁定内向状态。
- 研究意义
- 揭示了Spns2介导的S1P转运循环的结构基础，为开发更高效的Spns2抑制剂提供了蓝图，并增进了对S1P代谢和信号传导的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Spns2蛋白纯化与纳米盘重构
获得用于冷冻电镜的稳定Spns2蛋白样品。
在HEK293S GnTI-细胞中表达Spns2cryo，用去污剂提取膜蛋白，与Saposin A按1:15摩尔比重构至纳米盘。
冷冻电镜数据收集与结构解析
解析Spns2在不同状态下的高分辨率结构。
在300 kV Titan Krios上收集数据，使用K3相机，通过cryoSPARC和RELION进行图像处理，解析出内向、外向及中间态结构。
S1P转运机制的功能验证
验证Spns2是否为易化扩散单向转运体。
在不同pH、离子条件下测定S1P输出活性，并进行NBD-S1P摄取实验。
关键残基突变验证
验证结构观察到的S1P结合和构象转换关键残基的功能。
构建丙氨酸突变体，在HEK293-SphK1细胞中测定转运活性，并检查细胞表面定位和表达水平。
抑制剂16d结合结构解析
阐明16d抑制Spns2的分子机制。
在Spns2cryo样品中添加16d，解析3.6 Å冷冻电镜结构，并进行分子动力学模拟。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Millipore-Sigma | D5796-500ML |
| 胎牛血清 | Cytiva | SH30396.03 | |
| 青霉素-链霉素溶液(100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Sf-900 III SFM培养基 | Gibco | 12658027 | |
| Freestyle 293表达培养基 | Gibco | 12338018 | |
| 转染 | FuGENE 6转染试剂 | Promega | E2692 |
| TransIT-Insect转染试剂 | Mirus | MIR 6100 | |
| S1P输出实验 | NBD-鞘氨醇 | Cayman Chemical | 25348 |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白 | GoldBio | A-421-10 | |
| Hank平衡盐溶液 | Gibco | 14025076 | |
| N-甲基-D-葡糖胺 | Millipore-Sigma | 90928 | |
| D-葡萄糖 | Millipore-Sigma | G7021 | |
| LC-MS | d18:1 1-磷酸鞘氨醇 | Echelon Biosciences | S20001MG |
| d18:1 鞘氨醇 | Avanti Polar Lipids | 860490 | |
| 抑制剂处理 | Spns2抑制剂16d (SLF1081851) | MedChemExpress | HY-149004 |
| 蛋白纯化 | 洋地黄皂苷 | Thermo Scientific | 407560050 |
| γ-环糊精 | Millipore-Sigma | C4892-5G | |
| 镍-次氮基三乙酸琼脂糖 | Qiagen | 30250 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 29091596 | |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 29148721 | |
| Western blot | 鼠单克隆抗FLAG标签抗体 | MBL International | M185-3L |
| 鼠单克隆抗mCherry抗体 | Novus Biologicals | NBP1-96752SS | |
| 鼠单克隆抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8432 | |
| HRP标记抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| 细胞定位 | Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 |
| 冷冻电镜 | R1.2/1.3 400目金载网 | Quantifoil | 1210627 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| S1P输出实验 | 细胞密度1.0×10^6 cells/ml，NBD-鞘氨醇5 μM，37°C孵育60分钟 阅读提示：Methods 'NBD-S1P Export Assays'小节 |
| NBD-S1P摄取实验 | 细胞密度3×10^5 cells/well，NBD-S1P 1 μM，37°C孵育30分钟 阅读提示：Methods 'NBD-S1P Uptake Assay'小节 |
| 冷冻电镜样品制备 | 蛋白浓度10 mg/ml，添加1 mM S1P或300 μM 16d 阅读提示：Methods 'Cryo-EM sample preparation and data acquisition'小节 |
| 抑制剂16d的IC50测定 | 16d浓度梯度，数据以mean ± SEM表示（n=3生物学重复） 阅读提示：Figure 1E及其图注 |
| pH和离子条件实验 | pH 6.5、7.5、8.5；140 mM NaCl、KCl或NMDG-Cl 阅读提示：Methods 'NBD-S1P Export Assays'小节及Figure 6A、6B |