单细胞与bulk RNA-seq筛选致病Th17相关通路
比较EAE致病性Th17/Th1*细胞与SFB诱导稳态Th17细胞的差异表达通路。
对Il23rGFP/+与Il23rGFP/GFP骨髓嵌合小鼠的SC和SILP CD4+ T细胞进行scRNA-seq，并对分选的EAE Th17、Th1*、Treg及SFB Th17、Treg进行bulk RNA-seq。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过靶向代谢冗余实现对致病性Th17细胞的生态位选择性抑制
Niche-Selective Inhibition of Pathogenic Th17 Cells by Targeting Metabolic Redundancy.
实验完整度
高包含体外Th17培养、SFB稳态与EAE/结肠炎体内模型、骨髓嵌合体、CRISPR基因敲除、代谢示踪及功能验证
主要模型
体外分化的npTh17和pTh17细胞 SFB定植小鼠稳态Th17细胞模型 EAE模型中的2D2 TCR转基因CD4+ T细胞 Helicobacter hepaticus诱导的转移性结肠炎模型
重点核对
CRISPR电穿孔靶向效率约80%–90%，并在转移后4天以GFP靶向评估 SFB模型中7B8细胞转移后第15天分析SILP中RORγt/Foxp3和IL-17a EAE模型中2D2细胞转移后第15天分析SC中细胞数和EAE临床评分 Gpi1/G6pdx双敲除与Gapdh单敲除的细胞数比例比较 体外Seahorse检测OCR，并依次加入oligomycin、FCCP、rotenone加antimycin
摘要
靶向糖酵解一直被认为在治疗上难以实现，因为糖酵解具有必需的管家功能。然而，各个糖酵解步骤对环境的依赖性需求尚未被充分探索。我们表明，在小鼠T细胞中通过CRISPR靶向糖酵解会导致Th17细胞整体丢失，而糖酵解酶葡萄糖磷酸异构酶（Gpi1）的缺陷会选择性消除炎症性脑炎致病性和结肠炎致病性Th17细胞，而不会实质性影响稳态微生物群特异性Th17细胞。在稳态Th17细胞中，Gpi1失活导致的部分糖酵解阻断由磷酸戊糖途径通量和增加的线粒体呼吸所补偿。相反，炎症性Th17细胞处于已知会限制线粒体呼吸的低氧微环境中，这与Gpi1缺失不相容。我们的研究表明，通过靶向Gpi1抑制糖酵解可能是一种有效的治疗策略，对Th17介导的自身免疫性疾病具有最低毒性；并且更普遍地说，代谢冗余可以被利用来选择性靶向疾病过程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否找到炎症性致病Th17细胞所需、而稳态Th17细胞非必需的糖酵解基因或通路，以实现选择性治疗靶向。
- 核心机制
- Gpi1缺失后，稳态Th17细胞通过磷酸戊糖途径分流和增加的线粒体呼吸（经丙酮酸氧化）补偿糖酵解通量下降；炎症组织中低氧限制线粒体呼吸，使Gpi1缺陷的致病Th17细胞发生能量危机并被消除。
- 主要证据
- 在SFB稳态模型和EAE/结肠炎模型中，CRISPR靶向Gpi1使炎症性Th17细胞减少约75%，而稳态Th17细胞数量无显著影响；13C1,2-glucose示踪显示Gpi1 KO细胞PPP活性约增加3倍；Seahorse显示Gpi1 KO细胞ATP关联呼吸增加；Gpi1/Pdha1双敲除或Gpi1/G6pdx双敲除导致稳态Th17细胞显著减少；低氧（3% O2）培养使Gpi1 KO细胞出现类似Gapdh缺陷的生长缺陷。
- 研究意义
- 研究提示靶向Gpi1抑制糖酵解可能是对Th17介导自身免疫性疾病有效且毒性较小的治疗策略，并表明代谢冗余可被利用来选择性靶向疾病过程。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR体内筛选糖酵解基因对Th17细胞的作用
评估单个糖酵解基因在稳态和炎症性Th17细胞中的需求差异。
将Cas9转基因TCR转基因naive CD4+ T细胞电穿孔靶向Olfr2对照或候选基因，等数量共转移至SFB、EAE或结肠炎模型小鼠，比较KO/Olfr2细胞数比例。
验证Gpi1缺失对EAE发病和稳态Th17分化的影响
确定Gpi1是否为致病性Th17细胞和EAE诱导所必需，以及是否影响稳态Th17细胞分化和细胞因子产生。
转移Olfr2 KO或Gpi1 KO 2D2细胞并诱导EAE，监测临床评分；在SFB模型分析7B8细胞的RORγt/Foxp3和IL-17a。
同位素示踪验证PPP补偿
检验Gpi1缺失后PPP分流是否维持糖酵解通量。
体外npTh17和pTh17细胞经CRISPR靶向Gpi1或Olfr2，加入13C1,2-glucose，以GC-MS检测M1/M2标记并计算相对PPP活性；体内双敲除Gpi1与G6pdx。
验证线粒体呼吸补偿
确定Gpi1缺失后线粒体呼吸是否补偿ATP产生。
用GC-MS检测乳酸分泌，用Seahorse检测OCR和ATP关联呼吸；用antimycin A处理；体内双敲除Gpi1与Pdha1、Gls1或Hadhb。
验证低氧环境限制线粒体呼吸并导致Gpi1缺陷细胞消除
解释炎症性Th17细胞对Gpi1缺失更敏感的微环境机制。
在常氧（20% O2）和轻度低氧（3% O2）下培养gRNA靶向Th17细胞并计数；用pimonidazole标记EAE SC与SFB SILP的CD4+ T细胞；用Hif1a骨髓嵌合体评估低氧感受；在EAE模型中进行Gpi1 KO 2D2细胞的时间进程和EdU增殖分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式分析 | 抗小鼠CD4（RM4-5）eFluor450抗体 | ThermoFisher | 48-0042 |
| 抗小鼠CD45.1（A20）PE抗体 | ThermoFisher | 12-0453-82 | |
| 抗小鼠CD45.2（104）APC抗体 | ThermoFisher | 17-0454-82 | |
| 抗小鼠RORγt（B2D）PE抗体 | ThermoFisher | 12-6981 | |
| 抗小鼠FoxP3（FJK-16s）FITC抗体 | ThermoFisher | 53-5773 | |
| 抗小鼠IL-17A（eBio17B7）PE-Cyanine7抗体 | ThermoFisher | 25-7177-82 | |
| 抗小鼠IFN-γ（XMG1.2）PerCP-Cyanine5.5抗体 | ThermoFisher | 45-7311-82 | |
| 抗小鼠活性Caspase-3（C92-605）FITC抗体 | BD Bioscience | 559341 | |
| Western blot | 兔单克隆抗Gapdh抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 |
| 兔多克隆抗Gpi1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-26787 | |
| 兔多克隆抗Ldha抗体 | Cell Signaling Technology | 2012 | |
| 兔多克隆抗Tpi1抗体 | Abcam | ab96696 | |
| 兔多克隆抗G6pdx抗体 | Abcam | ab993 | |
| T细胞体外分化 | 抗小鼠CD3ε（145-2C11）抗体 | BioXCell | BP0001-1 |
| 抗小鼠CD28（37.51）抗体 | BioXCell | BE0015-1 | |
| 重组人TGFβ蛋白 | Peprotech | 100-21-10ug | |
| 重组小鼠IL-6蛋白 | R&D systems | 406-ML-200/CF | |
| 重组小鼠IL-1β蛋白 | R&D systems | 401-ML | |
| 重组小鼠IL-23蛋白 | R&D systems | 1887-ML | |
| EAE诱导 | MOG肽 | Genscript | 1340993 |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| 百日咳毒素 | Sigma-Aldrich | P7208 | |
| 代谢示踪 | 13C1,2-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-504 |
| 13C6-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | |
| Gapdh抑制 | Koningic acid | Santa Cruz | 74310-84-2 |
| Seahorse分析 | 寡霉素A | Cayman chemical | 11342 |
| FCCP | Cayman chemical | 370-86-5 | |
| 鱼藤酮 | Cayman chemical | 13995 | |
| Seahorse XFe96通量分析耗材包 | Agilent | 102601 | |
| 流式分析 | LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher | L34961 |
| eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| EdU检测 | EdU流式细胞术检测试剂盒647 | Baseclick | BCK-FC647-100 |
| 低氧标记 | Hypoxyprobe-生物素试剂盒 | Hypoxyprobe | HP10-100kit |
| ATP检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测 | Promega | G7570 |
| 电穿孔 | P3原代细胞4D-nucleofector X试剂盒L | Lonza | V4xp-3024 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR电穿孔与T细胞转移 | sgRNA电穿孔效率（约80%–90%）、每只小鼠转移100,000个细胞、转移后第15天分析 阅读提示：STAR Methods中sgRNA guide amplicon electroporation of naive CD4+ T cells及T cell transfer into mice |
| SFB稳态Th17模型 | SFB粪悬液两次灌胃、初始灌胃后96小时转移细胞、SILP和mLN分析时间点 阅读提示：STAR Methods中SFB model及图2A、图2G–2H图注 |
| EAE模型 | MOG35–55 100 μg/CFA皮下免疫、200 ng pertussis toxin第0天和第2天腹腔注射、EAE评分标准 阅读提示：STAR Methods中EAE model及Retroviral transduction and 2D2 TCRtg Cas9Tg T cell-mediated EAE |
| 结肠炎模型 | Helicobacter hepaticus第0天和第4天灌胃、第7天转移HH7-2细胞、LILP分析 阅读提示：STAR Methods中Colitis model |
| 低氧与pimonidazole检测 | pimonidazole 100 mg/kg Retro-orbital注射、3小时后取组织、体外低氧为3% O2 阅读提示：STAR Methods中Pimonidazole HCl labeling及图6A–6B图注 |
| Seahorse代谢分析 | 每孔100,000个细胞、oligomycin 1 μM、FCCP 0.5 μM、antimycin/rotenone 1 μM、重复数 阅读提示：STAR Methods中Seahorse Analysis及图4B–4C图注 |
| 同位素示踪与GC-MS | 13C1,2-glucose示踪12小时、13C6-glucose动力学取样时间点、PPP按M1/(M1+M2)计算 阅读提示：STAR Methods中Stable-isotope tracing, metabolite secretion and kinetic flux profiling by GC-MS |