IAV诱导细胞死亡及ZBP1/RIPK3依赖性验证
验证IAV感染触发ZBP1和RIPK3依赖的细胞死亡。
用IAV PR8感染野生型、Zbp1−/−和Ripk3−/− MEFs，检测细胞病变效应和活力；免疫印迹检测MLKL磷酸化。
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流感病毒Z-RNA诱导ZBP1介导的坏死性凋亡
Influenza Virus Z-RNAs Induce ZBP1-Mediated Necroptosis.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MEFs、HT-29、A549、LET1）、多种基因敲除/敲入小鼠模型，以及功能验证（细胞死亡、核膜破裂、中性粒细胞激活）和机制验证（ZBP1-RIPK3-MLKL通路、Z-RNA检测）。
主要模型
原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 人结肠癌细胞系HT-29 人肺腺癌细胞系A549 C57BL/6J小鼠及基因敲除小鼠（Zbp1−/−、Ripk3−/−、Mlkl−/−等）
重点核对
IAV PR8感染剂量：MOI=2或10（不同实验） 细胞死亡检测时间点：感染后8-24小时 基因敲除小鼠品系：Zbp1−/−、Ripk3−/−、Mlkl−/−、Ripk1−/−、Casp8DA 体内感染剂量：PR8 2500或6000 EID50/小鼠，鼻内接种 抑制剂浓度：zVAD 50 μM，GSK′843 5 μM，nucleozin 20 ng/mL
摘要
甲型流感病毒（IAV）是一种裂解性RNA病毒，在感染细胞中触发受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）介导的凋亡和混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）依赖的坏死性凋亡通路。ZBP1通过感知IAV RNA并激活RIPK3来启动RIPK3驱动的细胞死亡。在此，我们发现复制的IAV产生Z-RNA，其在感染细胞的细胞核中激活ZBP1。ZBP1随后在细胞核中启动RIPK3介导的MLKL激活，导致核膜破裂、DNA泄漏到细胞质中，并最终发生坏死性凋亡。核MLKL诱导的细胞死亡是中性粒细胞的强效激活剂，中性粒细胞是已知在强毒IAV疾病中驱动炎症病理的细胞类型。因此，MLKL缺陷小鼠在致死剂量IAV感染后表现出肺上皮核破裂减少、感染肺中性粒细胞募集减少以及存活率增加。这些结果提示Z-RNA作为一种新的病原体相关分子模式，并描述了一条ZBP1启动的从细胞核到质膜的“由内向外”死亡通路，在严重流感病例中具有潜在的致病后果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IAV感染是否产生Z-RNA，以及Z-RNA是否作为ZBP1的激活配体在细胞核中启动坏死性凋亡信号？
- 核心机制
- IAV复制产生Z-RNA（主要来源于缺陷病毒基因组RNA），在细胞核中被ZBP1感知，ZBP1招募并激活RIPK3，RIPK3磷酸化激活MLKL；核内MLKL导致核膜破裂和DNA泄漏，并转位至质膜执行坏死性凋亡。
- 主要证据
- 利用IAV感染多种细胞模型（MEFs、HT-29、A549等）结合基因敲除/敲入技术，通过免疫荧光、免疫印迹、免疫沉淀和RNA测序证实Z-RNA的产生、ZBP1与Z-RNA的共定位、RIPK3-MLKL通路的激活、核膜破裂及DNA泄漏；MLKL缺陷小鼠在致死剂量IAV感染后存活率提高、肺上皮核破裂减少、中性粒细胞浸润和NET形成减少。
- 研究意义
- 提出Z-RNA作为一种新的病原体相关分子模式，描述了一条ZBP1启动的从细胞核到质膜的“由内向外”死亡通路，并提示MLKL介导的核破裂和坏死性凋亡驱动IAV疾病严重程度，为重症流感治疗提供潜在干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Z-RNA的检测与鉴定
验证IAV感染产生Z-RNA，并确定其亚细胞定位和来源。
合成m8Gm修饰的Z-RNA和A-RNA对照，筛选抗Z-DNA抗血清；转染细胞验证抗体特异性；IAV感染后固定、蛋白酶K处理，免疫荧光检测Z-RNA；用RNase III、RNase A、DNase I和nucleozin处理验证信号特异性；比较IAV HD和LD病毒株。
ZBP1与Z-RNA的共定位及核内信号启动
验证ZBP1在细胞核中与Z-RNA共定位并启动下游信号。
在Zbp1−/− MEFs中稳定表达FLAG-ZBP1或其突变体，IAV感染后分离核质组分，免疫荧光共定位ZBP1和Z-RNA；免疫共沉淀检测ZBP1与RIPK3/MLKL的相互作用；构建核定位（NLS）或核输出（NES）ZBP1突变体检测细胞死亡动力学。
MLKL介导的核膜破裂和DNA泄漏验证
验证MLKL激活导致核膜破裂和DNA泄漏。
IAV感染后免疫荧光检测核纤层蛋白B1和emerin，观察核膜完整性和DNA泄漏；构建核定位MLKL（MLKL-Nuc）和胞质MLKL（MLKL-Cyto）诱导型细胞系，用二聚化剂激活后检测核膜破裂、DNA泄漏和细胞死亡；使用leptomycin B抑制核输出。
细胞凋亡在核膜破裂中的作用验证
验证RIPK3介导的凋亡是否参与核膜破裂。
使用zVAD、GSK′843或两者组合处理IAV感染细胞，检测核膜破裂；使用Ripk3−/−、Mlkl−/−、Ripk1−/−和Casp8DA MEFs检测核膜损伤；免疫荧光检测活化caspase-3定位。
体内MLKL对中性粒细胞募集和致死率的影响
评估MLKL在IAV感染体内的致病作用。
用不同剂量IAV PR8鼻内感染野生型、Zbp1−/−、Ripk3−/−和Mlkl−/−小鼠，监测生存率；检测肺病毒载量、CD8+ T细胞反应、肺上皮核破裂、中性粒细胞浸润和NET形成；体外用MLKL-Nuc或MLKL-Cyto细胞上清刺激中性粒细胞，检测NET形成和DAMPs释放。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| MAXblock封闭液 | Active Motif | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白酶K | NEW ENGLAND BioLabs | P8107 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | 90083 | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | FLAGIPT1 |
| 免疫沉淀裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 87787 | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78444 | |
| 免疫沉淀 | 3xFLAG肽 | Sigma | -- |
| RNA提取 | Tri试剂 | Sigma | -- |
| 逆转录 | 逆转录酶试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SuperScript IV VILO预混液 | Thermo Fisher Scientific | 11756050 | |
| PCR | Platinum SuperFi PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | SYBR green | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RNA-seq | HyperPrep建库试剂盒 | Kapa Biosystems | -- |
| ELISA | 小鼠IL-33 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M3300 |
| 小鼠HMGB1 ELISA试剂盒 | MYBioSource | MBS722248 | |
| 中性粒细胞分离 | Percoll分离液 | GE Healthcare | -- |
| ACK裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 鼠TNF-α | R&D Systems | 410-MT |
| 人TNF-α | R&D Systems | 210-TA | |
| 鼠TRAIL | R&D Systems | 1121-TL | |
| zVAD-FMK | Bachem | N-1510 | |
| 莱普霉素B | LC Laboratories | L-6100 | |
| B/B同源二聚化剂 | Clontech | 635059 | |
| Nucleozin | EMD Millipore | 492905 | |
| 多西环素 | Clontech | 631311 | |
| RIPK3抑制剂GSK'843 | GlaxoSmithKline | -- | |
| 流式细胞术 | TruStain FcX封闭剂 | Biolegend | -- |
| Ghost Violet 510活力染料 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD45-APC/Fire 750 | BioLegend | 103154 | |
| 抗小鼠CD3-PE | BioLegend | 100206 | |
| 抗小鼠CD8a-APC | BioLegend | 100712 | |
| 抗小鼠CD4-FITC | BioLegend | 100406 | |
| 抗小鼠IFN-γ-PE/Cy7 | BD Biosciences | 557649 | |
| 抗小鼠TNFα-BV785 | BioLegend | 506341 | |
| 免疫荧光 | 羊多克隆抗Z-NA抗体 | Novus Biologicals | NB100-749 |
| 小鼠单克隆抗Z-NA抗体，克隆Z22 | Absolute Antibody | Ab00783-3.0 | |
| 兔单克隆抗小鼠MLKL（磷酸化S345），克隆EPR9515(2) | Abcam | Ab196436 | |
| 兔单克隆抗人MLKL（磷酸化S358），克隆EPR9514 | Abcam | ab187091 | |
| 大鼠单克隆抗MLKL，克隆3H1 | EMD Millipore | MABC60 | |
| 兔多克隆抗Lamin B1 | Abcam | ab16048 | |
| 兔多克隆抗Emerin | Abcam | ab40688 | |
| 兔单克隆抗活化Caspase-3 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 羊多克隆抗髓过氧化物酶（MPO） | R&D systems | AF3667 | |
| 兔多克隆抗组蛋白H3（瓜氨酸R2+R8+R17） | Abcam | ab5103 | |
| 免疫印迹 | 小鼠单克隆抗甲型流感病毒NP，克隆AA5H | Bio-Rad | MCA400 |
| 兔多克隆抗甲型流感病毒PB1 | GeneTex | GTX125923 | |
| 兔多克隆抗甲型流感病毒NS1 | GeneTex | GTX125990 | |
| 兔多克隆抗甲型流感病毒血凝素（HA） | US Biological | I7651-41 | |
| 小鼠单克隆抗β-actin，克隆mAbGEa | GeneTex | GTX80809 | |
| 兔多克隆抗组蛋白H3 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 小鼠单克隆抗GAPDH，1E6D9 | Proeintech | 60004-1-Ig | |
| 兔单克隆抗FLAG | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 小鼠单克隆抗FLAG，克隆5A8E5 | GenScript | A00187 | |
| 兔多克隆抗HMGB1 | Cell Signaling Technology | 3935 | |
| 兔多克隆抗RIPK3 | ProSci | 2283 | |
| 小鼠单克隆抗ZBP1，克隆Zippy-1 | AdipoGen | AG-20B-0010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IAV感染细胞死亡实验 | IAV PR8 MOI=2；感染后8-24小时检测；MEFs基因型（WT、Zbp1−/−、Ripk3−/−） 阅读提示：Figure 1A及图注；STAR Methods中Viruses和Cell lines部分 |
| Z-RNA免疫荧光检测 | IAV PR8 MOI=10；感染后6小时固定；蛋白酶K处理20-40分钟；抗Z-NA抗血清稀释1:200 阅读提示：Figure 3G-3K及图注；STAR Methods中Immunofluorescence microscopy部分 |
| MLKL核膜破裂实验 | IAV PR8 MOI=2；感染后6-18小时检测；lamin B1和emerin染色；MLKL-Nuc和MLKL-Cyto诱导表达及二聚化剂激活时间 阅读提示：Figure 5及图注；STAR Methods中Generation of cell lines部分 |
| 体内IAV感染生存实验 | IAV PR8 2500或6000 EID50/小鼠鼻内接种；小鼠基因型（WT、Zbp1−/−、Ripk3−/−、Mlkl−/−）；生存监测21天；体重丢失>30%安乐死 阅读提示：Figure 7A-7B及图注；STAR Methods中in vivo IAV studies部分 |
| 中性粒细胞激活实验 | 骨髓来源中性粒细胞分离（Percoll梯度）；与细胞上清共培养24小时；NET形成检测（瓜氨酸化组蛋白H3染色） 阅读提示：Figure 7G-7N及图注；STAR Methods中Isolation and activation of neutrophils ex vivo部分 |