构建SCAF4/SCAF8敲除与回补细胞系
获得可诱导回补的单敲除和双敲除细胞，以研究SCAF4/SCAF8功能
用CRISPR-nickase在Flp-In T-REx HEK293中生成SCAF4 KO、SCAF8 KO及双KO，并携带Dox诱导的GFP-SCAF4或GFP-SCAF8抗CRISPR回补构建体；去Dox后检测回补蛋白丢失
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SCAF4与SCAF8：mRNA抗终止蛋白
SCAF4 and SCAF8, mRNA Anti-Terminator Proteins.
实验完整度
高含CRISPR敲除细胞系、体外肽结合实验、PAR-CLIP、TT-seq/3′-seq/mRNA-seq等多层证据及功能验证
主要模型
Flp-In T-REx HEK293细胞系 SCAF4/SCAF8单敲除与双敲除HEK293细胞 Dox诱导GFP-SCAF4/SCAF8与FLAG-SCAF4/SCAF8回补细胞系
重点核对
Dox去除后3–5天回补蛋白不可检测，确认敲除/回补体系 双敲除细胞单细胞集落形成实验，每孔200个细胞，11天固定染色 TT-seq中4SU 1 mM标记15分钟 DRB 100 μM处理3.5小时后释放并做DRB/TT-seq PAR-CLIP中365 nm、2000 J/m2紫外交联
摘要
真核生物抗终止蛋白通过抑制早期多聚腺苷酸化位点的使用来防止截短蛋白的产生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人SCAF4与SCAF8是否以及如何调控mRNA多聚腺苷酸化位点选择与转录终止。
- 核心机制
- SCAF4与SCAF8结合Ser2-Ser5双磷酸化RNAPII CTD并识别新生RNA上游序列，抑制早期替代polyA位点使用，从而防止提前切割、多腺苷酸化及转录终止；二者功能冗余，且SCAF8还是正向延伸因子。
- 主要证据
- CRISPR单/双敲除HEK293细胞显示dKO致死，mRNA-seq/3′-seq发现dKO中近端polyA位点使用增加、ALE事件达1,238个事件中的846个，TT-seq显示早期polyA位点下游提前终止，PAR-CLIP显示SCAF结合位点位于上调近端polyA位点上游50–200 nt，ZC3HAV1和USP15检测到截短蛋白。
- 研究意义
- 作者提出这是首个在真核多亚基RNA聚合酶转录基因中发挥作用的抗终止蛋白报道，并提示SCAF4/SCAF8协调延伸与终止转换，确保正确的polyA位点选择和RNAPII转录终止。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估敲除细胞的增殖与存活
判断SCAF4/SCAF8缺失对细胞生长的影响
进行生长曲线和克隆形成实验，比较单敲除与双敲除细胞在含Dox与去Dox条件下的增殖和集落形成能力
检测SCAF蛋白与磷酸化CTD及RNAPII复合物的结合
确定SCAF4/SCAF8识别的RNAPII CTD磷酸化形式及相互作用蛋白
FLAG-SCAF免疫沉淀、体外化学磷酸化CTD肽结合实验、无标记定量质谱及蛋白互作网络分析
全基因组检测新生转录与通读
分析敲除后新生RNA水平及转录通读情况
用4SU脉冲标记新生RNA并进行TT-seq，比较WT、SCAF4 KO、SCAF8 KO和dKO的metagene及通读比例
测定RNAPII延伸速率
判断SCAF4或SCAF8是否影响转录延伸速率
DRB处理后释放RNAPII，结合TT-seq在不同时间点检测延伸波峰位置并计算延伸速率
分析可变剪接与多聚腺苷酸化位点选择
确定敲除是否改变mRNA异构体及polyA位点使用
对mRNA-seq进行MISO分析，并进行3′-seq定量polyA切割位点使用及RED评分
定位SCAF4/SCAF8的RNA结合位点
检验SCAF蛋白是否直接结合其调控的早期polyA位点附近新生RNA
采用改良PAR-CLIP，将4SU掺入新生RNA后365 nm紫外交联，免疫沉淀SCAF蛋白并测序，分析T→C转换簇
检测截短蛋白产物
验证短mRNA异构体是否翻译为截短蛋白
用识别N端共同表位的抗体进行Western blot，检测ZC3HAV1和USP15的短异构体蛋白产物
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11965118 |
| 无四环素胎牛血清 | Clontech | 631106 | |
| 诱导表达 | 多西环素 | Clontech | 8634-1 |
| 质谱免疫沉淀 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Cayman Chemical | 10012628 |
| 新生RNA标记 | 4-硫尿苷 | Glentham Life Sciences | GN6085 |
| 酵母spike-in标记 | 4-硫尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | 440736 |
| 转录延伸抑制 | DRB（5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑） | Sigma-Aldrich | D1916 |
| 4SU RNA生物素化 | MTSEA生物素-XX连接臂 | Biotium | BT90066 |
| FLAG洗脱 | 3xFLAG肽 | Peptide Chemistry, The Francis Crick Institute | -- |
| CTD肽结合实验 | BioCTD28-Ser2P+Ser5P肽 | Peptide Chemistry, The Francis Crick Institute | -- |
| Western blot | FLAG单克隆抗体 | Sigma | F1804 |
| SCAF4多克隆抗体 | Bethyl | A303-951A | |
| SCAF8/RBM16多克隆抗体 | Bethyl | A301-037A | |
| USP15单克隆抗体（克隆1C10） | Novusbio | H00009958-M01 | |
| ZC3HAV1/ZAP多克隆抗体 | ProteinTech | 16820-1-AP | |
| 微管蛋白单克隆抗体 | Sigma | T5168 | |
| 纽蛋白单克隆抗体 | Sigma | V9131 | |
| qPCR | iTaq Universal SYBR Green预混液 | BioRad | 172-5124 |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| miRNeasy试剂盒 | QIAGEN | 217004 | |
| RNA纯化 | RNA MinElute纯化试剂盒 | QIAGEN | 74204 |
| DNase处理 | 无RNase DNase套装 | QIAGEN | 79254 |
| RNA提取 | PureLink RNA微型试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 12183020 |
| 4SU RNA富集 | μMACS链霉亲和素试剂盒 | Miltenyi | 130-074-101 |
| 逆转录 | TaqMan逆转录试剂 | Thermo Fisher Scientific | N8080234 |
| 银染 | SilverQuest银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | LC6070 |
| mNET-seq文库 | NEBNext多重小RNA文库构建套装（Set 1） | NEB | E7300S |
| mRNA-seq文库 | TruSeq HT试剂盒 | Illumina | 20020595 |
| TT-seq文库 | 链特异性TruSeq总RNA试剂盒 | Illumina | 20020597 |
| DRB/TT-seq文库 | NuGEN超低量V2试剂盒 | NuGEN | 0344 |
| Western blot | SuperSignal West Pico PLUS ECL试剂 | Thermo Fisher Scientific | 34577 |
| SuperSignal West Dura ECL试剂 | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| FLAG免疫沉淀 | ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 染色质消化 | Benzonase核酸酶 | MerckMillipore | 70746-4 |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| 4SU RNA富集 | M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11205D |
| PAR-CLIP | RNase I | Thermo Fisher Scientific | AM2294 |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | 3115887001 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 |
| 免疫荧光封片 | 含DAPI的VECTASHIELD抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 敲除与回补细胞系构建 | CRISPR sgRNA序列、Dox浓度1 μg/mL、去Dox后3–5天回补蛋白丢失、细胞为Flp-In T-REx HEK293 阅读提示：STAR Methods中Generation of stable cell lines及Figure 1B–1C、Figure S3D–S3E |
| 克隆形成与生长实验 | 去Dox预处理5天、每孔200个细胞、11天后固定染色、两个生物学重复各三孔 阅读提示：STAR Methods中Clonogenic survival assay与Growth curves及Figure 1D–1E、Figure S1E–S1F |
| CTD肽结合实验 | 肽为4个七肽重复28mer、各磷酸化修饰类型、NaCl梯度0.05/0.2/0.4/0.8/1 M 阅读提示：STAR Methods中Peptide binding assays及Figure 2B |
| TT-seq | 4SU 1 mM标记15分钟、RNA片段化200–500 nt、酵母4TU spike-in、测序平台HiSeq 2500 PE100 阅读提示：STAR Methods中TT-Seq及Figure S4A |
| DRB/TT-seq | DRB 100 μM处理3.5小时、释放后取样时间点、4SU加入时机、长基因60–300 kb 阅读提示：STAR Methods中DRB/TT-Seq及Figure 4A–4E |
| mRNA-seq与3′-seq | 去Dox 5天、MISO阈值Bayes factor ≥10且dPSI ≥ ±0.3、3′-seq高置信切割位点标准 阅读提示：STAR Methods中PolyA+ mRNA-Seq、3′-Seq、RNA-Seq alternative isoform analysis及Figure 5A–5B |
| PAR-CLIP | 4SU过夜100 μM并追加500 μM 2小时、UV 365 nm 2000 J/m2、簇阈值≥10条唯一读取且≥8个T→C、3个生物学重复中至少2个一致 阅读提示：STAR Methods中PAR-CLIP及Figure S7A、Figure 6A–6B |
| mNET-seq | RNAPII抗体MABI0601、文库为NEBNext小RNA套装E7300S、测序HiSeq4000 PE75 阅读提示：STAR Methods中mNET-Seq及Figure S7H–S7I |
| 截短蛋白检测 | ZC3HAV1与USP15抗体信息、dKO与WT比较、抗体识别N端共同表位 阅读提示：Figure 7D及Key Resources Table抗体条目 |