构建Cas9环状排列文库
获得覆盖Cas9序列的环状排列突变体文库，以筛选功能变体。
利用改造的转座子体外转座dCas9，连接原始N端和C端，并在不同位置断开；使用GGS重复序列作为连接肽，长度5、10、15和20个氨基酸。
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CRISPR-Cas9环状排列突变体作为基因组修饰的可编程支架
CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification.
实验完整度
高包含体外筛选、细菌CRISPRi、哺乳动物细胞编辑、免疫印迹及多种细胞系功能验证。
主要模型
大肠杆菌MG1655 CRISPRi报告菌株 HEK293T及HEK-RT1报告细胞系 HepG2、A549和HAP1细胞系
重点核对
环状排列文库通过双次分选富集功能克隆，富集倍数100-10,000倍 Cas9-CP切割活性通过大肠杆菌基因组切割致死实验和哺乳动物GFP报告基因破坏实验验证 ProCas9激活通过TEV、3Cpro、Potyvirus NIa和Flavivirus NS2B-NS3蛋白酶切割CP连接序列验证 ProCas9本底活性通过T7E1和TIDE分析内源PCSK9位点编辑验证 ProCas9 altruistic defense通过竞争性增殖实验和sgCIDE引导细胞耗竭验证
摘要
工程化天然蛋白质的能力对于未来实用生物学至关重要。CRISPR蛋白已经彻底改变了基因组修饰，然而CRISPR-Cas9支架对于融合或通过细胞触发激活并不理想。在这里，我们展示利用环状排列对Cas9进行拓扑重排，为RNA引导的基因组修饰和保护提供了先进的平台。通过系统探究，我们发现蛋白质末端可以定位在结合DNA的附近，为策略性融合功能结构域提供了一种直接的机制。此外，环状排列使得蛋白酶传感型Cas9（ProCas9s）成为可能，这是一类具有可编程输入和输出的独特单分子效应器。ProCas9s可以感知广泛的蛋白酶，并且我们证明ProCas9可以协调细胞对病原体相关蛋白酶活性的响应。总之，这些结果提供了一个更安全、更高效的基因组修饰酶和分子记录器的工具包，用于推进研究、农业和生物医学中的精准基因组工程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用环状排列重排Cas9拓扑结构，以改善其作为融合支架和可调控开关的功能？
- 核心机制
- 环状排列将Cas9原有N端和C端通过连接肽相连并在新位点断开，产生新的末端；将连接肽替换为蛋白酶切割序列后，蛋白酶切割可解除空间抑制，激活Cas9活性。
- 主要证据
- 在大肠杆菌CRISPRi和大肠杆菌基因组切割实验中，Cas9-CP保持与野生型相似的DNA结合和切割活性；在哺乳动物GFP报告基因和PCSK9位点编辑实验中，多个Cas9-CP显示80%以上野生型活性；ProCas9在TEV、3Cpro、Potyvirus和Flavivirus蛋白酶存在时被激活，免疫印迹显示活性ProCas9裂解为大小两个亚基。
- 研究意义
- 提供了一类更安全、更高效的基因组修饰酶和分子记录器，可用于研究、农业和生物医学中的精准基因组工程，并可作为可编程的病原体蛋白酶传感器和细胞防御系统。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选功能性Cas9环状排列变体
从文库中富集能够结合并抑制靶基因表达的功能性Cas9-CP。
在大肠杆菌CRISPRi报告系统中，用靶向RFP的sgRNA和GFP作为活性对照，通过流式细胞术连续两次分选富集RFP阴性且GFP阳性的细胞，并通过深度测序分析富集位点。
验证Cas9-CP的DNA结合和切割活性
验证筛选到的Cas9-CP是否保持野生型相似的DNA结合和切割功能。
在大肠杆菌CRISPRi实验中检测13个新Cas9-CP的RFP抑制能力；在大肠杆菌基因组切割致死实验中检测6个代表性Cas9-CP的切割活性；在哺乳动物GFP报告基因破坏实验中检测基因组编辑效率。
优化连接肽长度并构建蛋白酶激活型ProCas9
确定连接肽长度对活性的影响，并利用蛋白酶切割序列作为连接肽构建可激活的Cas9变体。
将6个代表性Cas9-CP与不同长度GGS连接肽（5-30个氨基酸）融合，检测CRISPRi活性；将连接肽替换为TEV蛋白酶切割序列（ENLYFQ/S，7个氨基酸）或3Cpro切割序列（LEVLFQ/GP，8个氨基酸），共表达活性或失活蛋白酶，检测GFP抑制恢复情况。
构建和筛选Potyvirus及Flavivirus蛋白酶响应型ProCas9
将ProCas9策略扩展到农业和医学相关病毒蛋白酶，并筛选特异性响应的连接肽。
将Potyvirus（TuMV、PPV、PVY、CBSV）NIa蛋白酶切割序列或Flavivirus（ZIKV、WNV、DENV2、YFV）衣壳蛋白C切割序列作为Cas9-CP199的连接肽，与相应蛋白酶共表达，通过大肠杆菌CRISPRi热图评估激活倍数。
在哺乳动物细胞中验证ProCas9的激活和本底活性
验证ProCas9在哺乳动物细胞中能否被蛋白酶激活，并评估稳定表达时的本底活性。
在HEK-RT1报告细胞系中瞬时转染ProCas9和蛋白酶，检测GFP破坏；构建慢病毒载体稳定整合ProCas9，检测内源PCSK9位点编辑（T7E1和TIDE）；在HepG2、A549和HAP1细胞中检测本底活性；通过免疫印迹验证蛋白酶切割机制。
开发基于ProCas9的细胞自主防御系统
验证ProCas9能否在检测到病毒蛋白酶后诱导细胞死亡，作为可编程的防御输出。
设计靶向基因组高重复序列的sgRNA（sgCIDE），在表达Cas9-wt或ProCas9Flavi的HEK293T和HAP1细胞中进行竞争性增殖实验；将ProCas9Flavi细胞与表达WNV或dTEV蛋白酶的慢病毒载体共培养，检测mCherry阳性细胞耗竭。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转座子文库构建 | MuA转座酶 | Thermo Fisher | F-750 |
| 大肠杆菌培养 | EZ富集限定生长培养基 | Teknoka | -- |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning Cellgro | 10-013-CV |
| 胎牛血清 | Seradigm | 1500-500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 伊格尔最低必需培养基 | ATCC | 30-2003 | |
| Ham F-12K营养混合物，Kaighn改良 | Corning Cellgro | 10-025-CV | |
| Iscove改良杜尔贝科培养基 | Gibco | 12440-053 | |
| Iscove改良杜尔贝科培养基 | HyClone | SH30228.01 | |
| 细胞STR鉴定 | GenePrint 10系统 | Promega | B9510 |
| 3730XL DNA分析仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 支原体检测 | Hoechst 33258染料 | Polysciences | 09460 |
| 深度测序文库制备 | S220聚焦超声仪 | Covaris | -- |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 深度测序 | HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- |
| 大肠杆菌荧光检测 | Tecan M1000酶标仪 | Tecan | -- |
| 大肠杆菌单细胞分析 | Sony SH800流式细胞仪 | Sony | -- |
| 大肠杆菌免疫印迹 | Trans-Blot Turbo转膜系统 | BioRad | -- |
| HRP标记DYKDDDDK标签（抗Flag）抗体 | Cell Signaling Technology | 2044 | |
| Pierce ECL免疫印迹底物 | Thermo Fisher | -- | |
| 慢病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 31985-070 | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 潮霉素B | Thermo Fisher Scientific | 10687010 | |
| 哺乳动物GFP报告基因诱导 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 哺乳动物细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 哺乳动物细胞流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 哺乳动物细胞荧光显微镜 | EVOS FL细胞成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 哺乳动物免疫印迹 | 4-20% Mini-PROTEAN TGX凝胶 | Bio-Rad | 456-1095 |
| 0.2微米PVDF膜 | Bio-Rad | 162-0177 | |
| 小鼠单克隆抗Flag-M2抗体 | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| 小鼠单克隆C-Cas9抗SpyCas9抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200751 | |
| 小鼠单克隆N-Cas9抗SpyCas9抗体 | Novus Biologicals | NBP2-36440 | |
| HRP标记小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 HRP | |
| HRP标记羊抗小鼠抗体 | GE Healthcare Amersham ECL | NXA931 | |
| Amersham ECL免疫印迹检测试剂 | GE Healthcare Amersham ECL | RPN2209 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质分子量标准 | Bio-Rad | 161-0374 | |
| 质粒构建 | Gibson组装 | NEB | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Cas9环状排列文库构建 | 连接肽长度（5、10、15、20个氨基酸）及转座反应条件 阅读提示：Methods“Transposon library construction”及Supplementary Figure S1A |
| 功能性Cas9-CP筛选 | 大肠杆菌菌株、培养基、aTc诱导浓度（200 nM）及双次分选门控策略 阅读提示：Methods“Screening for Cas9 circular permutants”及Figure S1C |
| ProCas9蛋白酶激活实验 | 蛋白酶切割序列、IPTG诱导浓度（50 μM）、aTc浓度（200 nM）及检测时间点 阅读提示：Methods“E. coli CRISPRi GFP repression assay”及Figure 2C、Figure S3 |
| 哺乳动物细胞稳定表达ProCas9 | 慢病毒载体启动子（EFS或EF1a）、嘌呤霉素筛选浓度及检测时间点（第3-10天） 阅读提示：Methods“Lentiviral vectors”和“Lentiviral transduction”及Figure 4B |
| 内源PCSK9位点编辑检测 | sgPCSK9-4序列、细胞系（HepG2、A549、HAP1）、T7E1和TIDE分析条件 阅读提示：Methods“Design of sgRNAs”和“Genome editing analysis”及Figure 4C-4E、4H |
| ProCas9细胞自主防御实验 | sgCIDE序列、竞争性增殖实验混合比例及流式检测时间点 阅读提示：Methods“Mammalian competitive proliferation assay”及Figure 5 |