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          具核梭杆菌通过调节自噬促进结直肠癌的化疗耐药

        具核梭杆菌通过调节自噬促进结直肠癌的化疗耐药

        Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy.

        作者信息TaChung Yu, Fangfang Guo, Yanan Yu, Tiantian Sun, Dan Ma, Jixuan Han, Yun Qian, Ilona Kryczek, Danfeng Sun, Nisha Nagarsheth, Yingxuan Chen, Haoyan Chen, Jie Hong, Weiping Zou, Jing-Yuan Fang
        PMID28753429
        期刊Cell
        发布时间2017-07-27
        DOI10.1016/j.cell.2017.07.008
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含患者队列（16S rDNA测序、qPCR）、细胞系体外实验、裸鼠移植瘤模型，并进行功能验证和机制验证。

        主要模型

        结直肠癌患者组织样本（队列1-3） HCT116和HT29结直肠癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型（HCT116、SW480细胞）

        重点核对

        患者队列中具核梭杆菌丰量与复发及无复发生存期的关联（qPCR、Log-rank检验） 具核梭杆菌（MOI=100）共培养对奥沙利铂和5-FU诱导结直肠癌细胞凋亡的影响（流式细胞术） 自噬抑制剂氯喹（CQ）对具核梭杆菌诱导化疗耐药的逆转作用（体外和体内） miR-18a*和miR-4802对ULK1和ATG7的靶向调控及对化疗耐药的影响（荧光素酶报告基因、mimics/inhibitors） TLR4和MYD88敲低对具核梭杆菌诱导的自噬激活、miRNA丢失和化疗耐药的影响（siRNA/shRNA）

        摘要

        肠道微生物群与慢性炎症和癌变相关。化疗失败是结直肠癌患者复发和预后不良的主要原因。在此，我们研究了肠道微生物群对结直肠癌患者化疗耐药的贡献。我们发现，在化疗后复发的结直肠癌患者组织中，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）丰度较高，并与患者临床病理特征相关。此外，我们的生物信息学和功能研究表明，具核梭杆菌促进结直肠癌对化疗的耐药。机制上，具核梭杆菌靶向TLR4和MYD88先天免疫信号通路及特定microRNA，激活自噬通路并改变结直肠癌化疗反应。因此，具核梭杆菌协调Toll样受体、microRNA和自噬的分子网络，在临床、生物学和机制上控制结直肠癌化疗耐药。检测和靶向具核梭杆菌及其相关通路将为临床管理提供有价值的见解，并可能改善结直肠癌患者的预后。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        具核梭杆菌是否及如何影响结直肠癌患者的化疗耐药？
        核心机制
        具核梭杆菌通过TLR4/MYD88信号通路选择性下调miR-18a*和miR-4802，导致ULK1和ATG7表达上调，激活自噬通路，从而促进结直肠癌细胞对奥沙利铂和5-FU的化疗耐药。
        主要证据
        患者队列分析显示具核梭杆菌丰量与化疗后复发相关；体外细胞实验表明具核梭杆菌通过自噬途径减少化疗诱导的凋亡；裸鼠移植瘤模型证实具核梭杆菌在体内促进化疗耐药，且该效应可被自噬抑制剂、miR-18a*/miR-4802过表达或TLR4/MYD88敲低逆转。
        研究意义
        检测和靶向具核梭杆菌及其相关通路可能为结直肠癌患者的预后预测和临床管理提供有价值的信息。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        临床样本中具核梭杆菌丰度与化疗后复发的关联分析

        探究具核梭杆菌丰度是否与结直肠癌患者化疗后复发相关。

        对复发和非复发患者的结直肠癌组织进行16S rDNA测序和qPCR定量具核梭杆菌，分析其与临床病理特征及无复发生存期的关系。

        2

        具核梭杆菌对结直肠癌细胞自噬通路的影响

        验证具核梭杆菌是否激活结直肠癌细胞的自噬通路。

        将具核梭杆菌与结直肠癌细胞共培养，通过RNA-seq、Western blot、实时PCR、自噬通量检测（mRFP-EGFP-LC3、透射电镜）评估自噬相关指标。

        3

        具核梭杆菌通过自噬途径诱导化疗耐药

        验证具核梭杆菌是否通过激活自噬使结直肠癌细胞对奥沙利铂和5-FU产生耐药。

        在具核梭杆菌共培养条件下，用奥沙利铂和5-FU处理细胞，检测凋亡（流式细胞术、Western blot），并用CQ或ULK1/ATG7 siRNA干预。

        4

        miR-18a*和miR-4802对ULK1和ATG7的靶向调控

        探究具核梭杆菌上调ULK1和ATG7的分子机制。

        通过miRNA表达谱分析、荧光素酶报告基因实验、mimics/inhibitors转染验证miR-18a*和miR-4802对ULK1和ATG7的靶向关系。

        5

        TLR4/MYD88通路在具核梭杆菌介导的化疗耐药中的作用

        验证TLR4/MYD88信号通路是否参与具核梭杆菌诱导的自噬激活和化疗耐药。

        用TLR4和MYD88 siRNA/shRNA敲低表达，检测对具核梭杆菌诱导的miRNA丢失、自噬激活和化疗耐药的影响。

        6

        体内验证具核梭杆菌对化疗耐药的影响及机制

        在动物模型中验证具核梭杆菌促进化疗耐药及其分子机制。

        建立裸鼠皮下移植瘤模型，给予具核梭杆菌、化疗药物、CQ、miRNA病毒或shRNA病毒处理，监测肿瘤生长和检测相关指标。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        16S rDNA测序实时荧光定量PCR免疫组织化学
        验证细胞功能变化
        流式细胞术CCK-8法TUNEL法
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹法实时荧光定量PCR
        验证自噬活性
        透射电子显微镜共聚焦显微镜
        验证机制链路
        荧光素酶报告基因实验RNA干扰miRNA模拟物/抑制剂转染
        评估体内效果
        异种移植瘤模型
        数据分析与统计
        RNA测序单样本基因集富集分析Kaplan-Meier生存分析受试者工作特征曲线分析单因素和多因素Cox回归

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        Western blot抗ACTB-HRP抗体Sigma-AldrichA1978
        抗LC3B抗体Sigma-AldrichL7543
        抗P62抗体Cell Signaling Technology8025
        抗Cleaved Caspase9抗体Cell Signaling Technology9505
        抗Cleaved Caspase3抗体Cell Signaling Technology9664
        抗Cleaved Caspase6抗体Cell Signaling Technology9761
        抗Cleaved Caspase7抗体Cell Signaling Technology8438
        抗Cleaved PARP抗体Cell Signaling Technology5625
        抗p-H2AX(Ser139)抗体Cell Signaling Technology9718
        抗p-AMPK(α)(Thr172)抗体Cell Signaling Technology2535
        抗Beclin1抗体Cell Signaling Technology3495
        抗ATG5抗体Cell Signaling Technology12994
        抗ATG12抗体Cell Signaling Technology4180
        抗ATG16L1抗体Cell Signaling Technology8089
        抗ATG3抗体Cell Signaling Technology3415
        抗MYD88抗体Cell Signaling Technology3699
        抗ULK1抗体Abcamab65056
        抗p-ULK1(Ser556)抗体Abcamab203207
        抗ATG7抗体Abcamab52472
        抗TLR4抗体Abcamab13556
        药物处理奥沙利铂Selleck ChemicalsS1224
        5-氟尿嘧啶Selleck ChemicalsS1209
        多柔比星Selleck ChemicalsS1208
        自噬抑制氯喹Sigma-AldrichC6628
        流式细胞术FITC Annexin V凋亡检测试剂盒IBD Biosciences556547
        可固定活性染料510BD Biosciences564406
        DNA提取QIAamp DNA FFPE组织提取试剂盒QIAGEN56404
        RNA提取miRNease FFPE试剂盒QIAGEN217504
        TUNEL检测原位细胞死亡检测试剂盒，PODRoche11684817910

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        患者队列分析
        队列来源、样本类型（新鲜冷冻或FFPE）、复发与非复发分组、F. nucleatum定量方法及截断值（-10.3 deltaCT）
        阅读提示：Methods 'Patients and Clinical Specimens' 及 Figure 1 legend
        细胞共培养与自噬检测
        细胞系（HCT116、HT29）、F. nucleatum MOI=100、共培养时间（文中未明确说明）、自噬通量检测方法（mRFP-EGFP-LC3、透射电镜）
        阅读提示：Results 'F. nucleatum Promotes Cancer Autophagy Activation' 及 Figure 2 legend
        化疗耐药功能实验
        化疗药物浓度（文中未明确说明）、CQ浓度、siRNA转染序列及效率、凋亡检测时间点
        阅读提示：Results 'F. nucleatum Induces Cancer Chemoresistance via the Autophagy Pathway' 及 Figure 3 legend
        miRNA靶向验证
        荧光素酶报告基因质粒构建（野生型/突变型）、miRNA mimics/inhibitors浓度（20 nmol/L）、转染试剂及检测时间
        阅读提示：Methods 'Luciferase Assay' 及 Figure 4 legend
        体内移植瘤实验
        小鼠品系（BALB/c nude）、细胞接种数量（HCT116 5×10^6，SW480 1×10^7）、给药剂量（Oxaliplatin 5/7.5/10 mg/kg，5-FU 50 mg/kg，CQ 30 mg/kg）、给药途径和频率、每组n=8
        阅读提示：Methods 'Mice' 及 Figure 5、6 legend

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