建立内源性标记核糖体亲和纯化方法
从细胞质提取物中特异纯化哺乳动物核糖体并鉴定相互作用蛋白。
利用CRISPR/Cas9在eL36和eS17的C端添加FLAG标签，以GFP-FLAG细胞评估背景，进行FLAG免疫沉淀和LC-MS/MS，取两个亚基数据集交集定义RAPs。
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哺乳动物核糖体相互作用组揭示核糖体功能多样性与异质性
The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity.
实验完整度
高小鼠ESCs亲和纯化联合定量蛋白质组、iCLIP、核糖体图谱及多组突变敲低功能验证，含体内外多层级证据。
主要模型
小鼠E14胚胎干细胞（ESCs） eL36-FLAG与eS17-FLAG敲入ESC系 PKM2-FLAG-HA敲入ESC系 PKM敲低ESC及核糖体图谱
重点核对
eL36-FLAG与eS17-FLAG双亚基数据集交集，SAINT≥0.56且FC≥4定义RAPs RNase A与嘌呤霉素处理定量TMT-MS区分mRNA依赖与新生肽依赖RAPs PKM2 iCLIP结合核糖体图谱检测PKM敲低后翻译效率变化 SILAC定量MS比较PKM2核糖体与eL36核糖体富集蛋白 BirA邻近标记eL31-Avitag分离ER与胞质核糖体
摘要
在真核生物进化过程中，核糖体体积显著增大，形成了一个功能未知的表面暴露rRNA外壳，可能为尚未鉴定的相互作用蛋白提供界面。为研究此类蛋白相互作用，我们建立了一种核糖体亲和纯化方法，意外鉴定出数百种核糖体相关蛋白（RAPs），涵盖代谢、细胞周期以及RNA和蛋白修饰酶等类别，这些蛋白在功能上使哺乳动物核糖体多样化。通过进一步表征RAPs，我们发现核糖体上存在ufmylation——一种后生动物特有的翻译后修饰，并明确了其直接底物。此外，我们证明代谢酶丙酮酸激酶肌肉型（PKM）与内质网（ER）相关核糖体的亚群相互作用，作为RNA结合蛋白在ER目的地mRNA的翻译中发挥非经典功能。因此，RAPs将生命最古老的分子机器之一与多种细胞过程联系起来，为蛋白表达提供了额外一层的调控潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物核糖体相互作用组的组成及其是否赋予核糖体功能多样性和亚细胞异质性。
- 核心机制
- RAPs直接或经mRNA/新生肽与核糖体结合；UFL1介导核糖体ufmylation修饰uS3、uS10、uL16和eIF6；PKM2结合ER相关核糖体并作为翻译激活因子促进ER目的地mRNA翻译。
- 主要证据
- ESC中eL36/eS17-FLAG亲和纯化联合LC-MS/MS鉴定约400种RAPs；RNase/嘌呤霉素定量MS和免疫印迹验证直接结合；His-Ufm1两步纯化鉴定ufmylation底物；PKM2 iCLIP、核糖体图谱和亚细胞分级显示PKM2结合并调控ER目的地mRNA翻译。
- 研究意义
- 揭示核糖体是连接代谢、细胞周期和RNA/蛋白修饰等多种细胞过程的动态枢纽，为蛋白表达提供额外调控层，并为核糖体异质性和亚细胞翻译调控研究奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
区分直接、mRNA依赖和新生肽依赖RAPs
确定RAPs与核糖体结合的分子基础。
对eL36-FLAG免疫沉淀样品进行RNase A消化或嘌呤霉素处理，采用10-plex TMT标记和MS3定量，比较处理与对照的蛋白丰度。
验证RAPs并定义核糖体相互作用组
正交验证候选RAPs的直接结合并确定核糖体相互作用组。
对代表性RAPs进行免疫印迹、蔗糖梯度分级（EDTA或RNase A处理）及内源性HA-PKM与HA-GFP对照实验。
鉴定核糖体ufmylation修饰及底物
验证UFL1与核糖体结合并鉴定被ufmylation修饰的核糖体蛋白。
用ufmylation特异性抗体检测核糖体IP和蔗糖梯度组分；在eL36-FLAG细胞中表达6×His-Ufm1，经FLAG IP和变性条件下Ni-NTA纯化后LC-MS/MS鉴定底物。
表征PKM2与核糖体结合的机制
确定PKM2与翻译核糖体结合的位点和结构要求。
在翻译抑制剂CHX、LTM、HAR处理下进行蔗糖梯度分级检测PKM2分布；构建PKM-K367M和H464A纯合敲入ESC检测核糖体结合。
检测PKM2的翻译激活功能及RNA靶标
验证PKM2是否作为翻译激活因子并鉴定其直接结合的mRNA。
采用PP7-PP7bs系链功能实验检测报告基因翻译；对PKM2-FLAG-HA细胞进行FAST-iCLIP；siRNA敲低PKM后进行核糖体图谱分析翻译效率变化。
分析PKM2在ER核糖体亚群的富集及mRNA定位功能
验证PKM2是否富集于ER相关核糖体并影响其靶mRNA的亚细胞定位。
分离PKM2相关80S核糖体进行SILAC定量MS；利用eL31-Avitag与ER或胞质BirA邻近标记分离ER核糖体；PKM敲低后亚细胞分级qPCR检测靶mRNA分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证RNA-蛋白相互作用
验证翻译调控功能
验证亚细胞定位
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Knockout-DMEM培养基 | Life Technologies | 10829018 |
| Embryomax胎牛血清 | EMD Millipore | ES-009-B | |
| 非必需氨基酸 | EMD Millipore | TMS-001-C | |
| L-谷氨酰胺 | EMD Millipore | TMS-002-C | |
| 白血病抑制因子 | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SILAC标记 | 无精氨酸和赖氨酸DMEM | Gibco | A1443101 |
| Knockout血清替代物 | Gibco | 10828010 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | |
| 同位素编码L-赖氨酸（13C6, 15N2） | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291-H | |
| 同位素编码L-精氨酸（13C6, 15N4） | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539-H | |
| 基因组编辑 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | 11668027 |
| 稳定整合 | 线性嘌呤霉素抗性盒 | Clontech | 631626 |
| 细胞培养 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T176 |
| 多聚核糖体分析 | 三尖杉酯碱 | Abcam | ab141941 |
| 乳咪霉素 | EMD Millipore | 506291 | |
| SUPERase In RNA酶抑制剂 | Ambion | AM2694 | |
| TurboDNA酶 | Ambion | AM2238 | |
| 无EDTA完全蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| RNase A | Invitrogen | AM2270 | |
| RNase T1 | Invitrogen | AM2283 | |
| 蛋白质沉淀 | Proteoextract蛋白沉淀试剂盒 | EMD Millipore | -- |
| 免疫沉淀 | FLAG抗体（M2） | Sigma-Aldrich | F3165 |
| Dynabeads M-270环氧磁珠 | Life technologies | 14301 | |
| Dynabeads抗体偶联试剂盒 | Life technologies | 14311D | |
| FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F3290 | |
| 质谱样品制备 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23228 |
| 胰蛋白酶/Lys-C | Promega | V5071 | |
| ProteaseMAX表面活性剂 | Promega | V2071 | |
| TMT定量蛋白质组学 | TMT-10plex同量异序标记试剂盒 | Thermo Scientific | 90110 |
| His-Ufm1纯化 | Ni-NTA琼脂糖浆 | Thermo Scientific | R90101 |
| iCLIP | RNase I | ThermoFisher Scientific | AM2294 |
| 抗FLAG琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗HA琼脂糖珠 | Pierce | -- | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0210 | |
| T4 RNA连接酶1 | NEB | M0204 | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 | |
| Circligase-II | Epicentre | CL9021K | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| SYBR Green I | Thermo Fisher Scientific | S7563 | |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778 |
| 核糖体图谱 | TRIzol | Invitrogen | 15596-018 |
| Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒（人/鼠/大鼠） | Illumina | MRZG126 | |
| RNA Clean & Concentrator 5纯化柱 | Zymo Research | R1016 | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S | |
| 截短型T4 RNA连接酶2 | NEB | M0242S | |
| 通用miRNA克隆接头 | NEB | S1315S | |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080-044 | |
| CircLigase | Illumina | CL4115K | |
| Phusion高保真DNA聚合酶 | Thermo Fisher | F530S | |
| 系链功能实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 亚细胞分级 | 天然膜提取试剂盒 | Calbiochem | 444810 |
| iScript预混液 | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoAdvanced SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725270 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 核糖体亲和纯化与质谱鉴定 | eL36-FLAG和eS17-FLAG敲入ESC系；每IP 8 mg总蛋白；SAINT≥0.56且FC≥4 阅读提示：Methods“Mass spectrometry and Data Analysis”及Figure 1B |
| RNase与嘌呤霉素处理定量 | RNase A 2 ng/μl 25°C 10 min；嘌呤霉素200 μM 37°C 10 min；三个生物学重复；FDR<0.15和NPV>0.99阈值 阅读提示：Methods“Mass spectrometry and Data Analysis”及Figure 2A |
| PKM2 iCLIP与核糖体图谱 | UV交联0.35 J cm⁻²；PKM siRNA 20 nM转染36 h；敲低约70%；iCLIP富集与翻译效率变化相关分析 阅读提示：Methods“iCLIP and Data Analysis”和“Ribosome Profiling and Data Analysis”及Figure 6 |
| 翻译抑制剂蔗糖梯度分级 | CHX 100 μg/ml 2 min；LTM 25 μM 10 min；HAR 2 μg/ml 10或40 min；10–45%蔗糖梯度 阅读提示：Methods“Polysome Analysis”及Figure 5B |
| ER核糖体邻近标记与SILAC | eL31 C端Avitag；诱导型ER或胞质BirA；SILAC heavy/light比值2.5 S.D. cutoff；两个生物学重复 阅读提示：Methods“Mass spectrometry and Data Analysis”及Figure 7A-B |